微生物的基本研究方法

在微生物的科学世界中，我们经常会发现微生物的研究是比较复杂的，因为长时间在显微镜下去观察微生物，往往需要很长的时间，一般就会盯着好几个小时，这样不仅无法及时记录结果，还会错过一些关键细节的捕捉，所以在研究过程中，微生物的数据记录是非常关键的，尽管现在电脑科技非常的发达，但是对于团队型实验项目还是可以同步进行的，但是如果是微生物学的兴趣爱好者，往往是单独进行研究，就无法产生自己的数据记录了。所以我们对于微生物的研究不单单是停留在表面，更多要考虑合适的方法， 比如我们发现如果用扩大法去研究，这样会产生意想不到的效果，我们现在杀菌消毒用到巴氏消毒法，那么很早以前有一位科学家就叫做巴斯德，它在研究细菌的时候改变了很多因素，创造了很多奇迹，我们最典型的知道他用了一锅肉汤培养了细菌，我们肉眼可见的实验就在眼前发生了，后来我们用同样的方法在培养皿中制作了培养基，培养出五颜六色，形状绚丽的菌落，为我们方便计数和研究提供了很大的帮助。所以在研究微生物科学的过程中，不能单单依靠当代科技产品，也要学会用一定的方法去设计实验，通过多个角度去观察实验中微生物的变化，这样的实验才会变得有趣!

在高通量测序的大力推动和快速发展下，微生物组学研究进入到了多组学的时代。为更好满足科研人员多组学联合分析需求，美格基因基于科研需求及以往项目经验，全新推出微生物组+代谢组联合分析解决方案，克服单一组学研究局限性，多角度解释科学问题！本期分享几篇微生物组+代谢组多组学应用案例，为大家提供微生物组+代谢组多组学研究思路。肠道微生物菌群与人类免疫细胞动力学有关原名：The gut microbiota is associated with immune cell dynamics in humans译名：肠道微生物菌群与人类免疫细胞动力学有关期刊：NatureIF：42.778发表时间：2020.11.25DOI号：10.1038/s41586-020-2971-8研究方法：16S+宏基因组+代谢组该研究首次证明肠道微生物群直接塑造了人类免疫系统的构成，通过探究肠道微生物菌群与人体外周免疫细胞计数日常变化之间的关系，有效的将人体肠道微生物菌群与免疫系统的动态联系起来。尽管缺乏淋巴细胞和其他免疫细胞亚型等详情，但该研究直接在患者机体进行研究，添补了目前在微生物群研究的重要空白：基于动物模型的微生物群-免疫相互作用研究与临床数据之间的相关性。该研究结果表明，微生物菌群会影响人体的系统免疫，其研究结果为微生物菌群靶向干预措施以改进免疫治疗和免疫介导性和炎症性疾病的治疗打开了大门。地中海饮食对超重和肥胖受试者的干预可降低血浆胆固醇并导致与能量摄入无关的肠道微生物组和代谢组改变原名：Mediterranean diet intervention in overweight and obese subjects lowers plasma cholesterol and causes changes in the gut microbiome and metabolome independently of energy intake译名：地中海饮食对超重和肥胖受试者的干预可降低血浆胆固醇并导致与能量摄入无关的肠道微生物组和代谢组改变期刊：Gut影响因子：17.943发表时间：2020.2DOI：10.1136/gutjnl-2019-319654研究方法：宏基因组+代谢组本研究旨在通过地中海饮食（MD）对超重和肥胖人群的干预试验探究MD对代谢健康、肠道微生物组和系统性代谢组的影响。在研究期间，摄入与日常能量一致的MD后监测受试者饮食的依从性，代谢参数，肠道微生物组和全身代谢组，结果发现受试者血液胆固醇和血浆及尿液中肉碱水平的降低与MD的依从性成正比；同时MD导致了微生物组和代谢组的多种变化，如增加了降解膳食纤维的普氏粪杆菌等。这一结论有助于制定改善代谢健康的饮食策略。炎性肠病（IBD）微生物代谢组学：优劣与未知原名：IBD Microbial Metabolome: The Good, Bad, and Unknown译名：炎性肠病（IBD）微生物代谢组学：优劣与未知期刊：Trends in Endocrinology and metabolismIF：9.777发表时间：2020.05DOI：10.1016/j.tem.2020.05.001研究方法：16S+宏基因组+代谢组在胃肠道内，微生物衍生的代谢物是宿主与微生物相互作用的关键组分，并已被证明对诸如II型糖尿病（T2DM）和炎症性肠病（IBD）等代谢疾病有重要影响。越来越多的研究表明肠道菌代谢物是导致宿主发病的重要原因，有望通过调整肠道微生物群及代谢物来治疗IBD，本研究从转录组学与菌群功能、菌群代谢物与宿主、菌群代谢物与临床应用三个角度客观地论述了通过调整肠道微生物群及代谢物来治疗IBD方法的优劣，并提醒人们在临床治疗上应该慎重。16S rRNA测序虽然可以方便地研究微生物群的组成，但由于目前对于菌群基因库认知的不完全性，限制了对有关代谢物影响的理解。宏基因组测序为现有的基因提供了更深入的了解，但这些基因中的大多数功能仍然未知。为了进一步了解相关微生物菌群的功能潜力，可以进行微生物组+代谢组多组学联合分析，在了解微生物多样性的同时，探寻微生物对机体生化和功能的影响。上述几篇研究结合微生物组和代谢组多组学联合方法，构建了微生物与代谢组之间的网络关系，克服了单一组学研究的局限性，多角度理解微生物与代谢关系之间的联系，填补了微生物与代谢关系研究数据上的空白。您可能还喜欢：不同土壤深度之间微生物格局有何不同？最新！2020年美格基因项目文章年终大盘点

医学微生物学笔记（内容来源：公众号白衣静思）第一章：绪论一、定义：1、微生物（microorganism）：微生物存在于自然界的一大群体形微小、结构简单（单细胞或非细胞）、肉眼直接看不见，必须借助光学显微镜或电子显微镜放大数百倍、数千倍。甚至数万倍才能观察到的微小生物。2、医学微生物学（medical microbiology）：研究和人类疾病有关的微生物的生物学性状及其与人体相互作用的规律性（致病性、免疫机制），从而为感染性疾病的诊断、治疗和预防提供了依据和有效措施的一门科学。二、微生物的分类： 三、致病微生物病原微生物：少数具有致病性，能引起人类、植物病害的微生物（只占所有微生物的少数）。机会致病性微生物：许多微生物在长期的进化过程中和人形成了共生关系，这些微生物在机体健康和正常情况下致病，但在特定条件下（如机体抵抗力低下），能使人和动物发病的微生物。这类微生物被称为条件治病微生物或机会致病微生物。四、微生物学的两位奠基人：科赫、巴斯德（1）科赫：贡献：1、第一个分离到病原菌-炭疽芽胞杆菌2、发明了细菌的分离培养技术和染色技术3、提出科赫法则:①特殊的病原菌应在同一种疾病中查见，在健康人中不存在；(存在携带而不患病者，如小儿麻痹病毒仅会使部分人患病）②该特殊病原菌能被分离培养得纯种；③该纯培养物接种至易感动物，能产生同样病症；（霍乱、结核在不同个体常产生不同的症状）④自人工感染的实验动物体内能重新分离得到该病原菌纯培养。（2）巴斯德：贡献：1、第一个以确切的证据证明微生物与传染病之间的关系2、巴氏灭菌法3、提出人类的传染病可能是微生物引起的假设4、曲颈瓶实验5、发现了鸡霍乱弧菌6、1879发现牛羊感染炭疽病是因吃了炭疽感染的草。五、免疫学：㈠主动免疫；㈡被动免疫。六、相关知识点1、支原体：可无生命人工培养；衣原体：活细胞培养；阮粒：活细胞培养。2、区分细菌和古细菌的关键：古细菌含有16sRNA。古细菌主要有：产甲烷菌、极端嗜盐菌、极端嗜酸菌、极端嗜热菌七、简史：Walter Reed：发现第一个对致病的黄热病病毒，第一个证实由蚊传播的病毒Alexander Fleming：发现青霉素Montagnier：发现HIVPrusiner：发现阮粒Ulmer：1993年制备核酸疫苗伊凡洛夫斯基：第一个发现病毒（烟草花叶病毒）欧立希：提出神奇子弹假说，1909年发明606治疗梅毒螺旋体弗劳里：1940年改良生产出高产青霉素杜马克：1935年发明磺胺类药物巴斯德：1860年提出传染病的病因学说：传染病是由微生物引起的（图片素材来自网络，侵权可联系删除）（你的支持是我的最大动力，点个赞再走吧！）

今天为大家分享几篇微生物组+代谢组多组学应用在肠道样本中的文献案例。案例1题目：饮食和运动在肠道微生物-宿主共代谢中的作用研究期刊：mSystemsIF：6.633发表时间：2020.12DOI号：10.1128/mSystems.00677-20研究方法：16S+宏基因组+靶标代谢组本文为了研究饮食和体育锻炼对新陈代谢和肠道微生物群的单独和联合影响，收集运动员和不经常运动的人的粪便和尿液样本，比较两组样本之间代谢表型和肠道微生物的差异。结果发现，两组样本间表现出独特的代谢表型和微生物多样性差异。微生物多样性与高度坚持健康饮食习惯和身体锻炼相呼应，并与一系列不同的微生物衍生代谢物相关。案例2题目：代谢和代谢紊乱与微生物群：与肥胖、脂质代谢和代谢健康相关的肠道微生物群：病理生理学和治疗策略期刊：GastroenterologyIF：17.373发表时间：2020.11.27DOI号：10.1053/j.gastro.2020.10.057研究方法：16S+宏基因组+代谢组本文通过对肠道微生物群与代谢性疾病、脂质代谢的关系等方面进行综述，对于促进理解代谢组学和微生物组学的关联性研究、了解当下的研究背景和热点有很高的参考价值。目前在流行病学研究和对无菌小鼠粪便移植影响的研究中发现肠道微生物群的变化与肥胖和2型糖尿病有关，本综述结合小鼠模型的相关研究，讨论将其用于人体健康代谢改善的方法。案例3题目：妊娠糖尿病中肠道细菌和代谢特征的改变及其相互作用期刊：Gut MicrobesIF：7.740发表时间：2020.11DOI号：10.1080/19490976.2020.1840765研究方法：16S+宏基因组+代谢组经证实，宏基因组学与代谢组学联合分析是揭示肠道微生物组成和各种疾病功能的有效方法。本研究通过分析肠道微生物和代谢产物之间的相关性，探究了妊娠糖尿病中肠道细菌和代谢特征的改变及其相互作用。研究发现妊娠糖尿病患者的微生物和代谢特征与健康孕妇显著不同，其中Lachnospiraceae和Enterobacteriaceae的OTUs与参与宿主糖类代谢的几种代谢物形成强烈的共现关系，表明微生物成分和代谢功能的改变可能与妊娠糖尿病的发病机制和病理生理有关。点 评16S rRNA测序虽然可以方便地研究微生物群的组成，但由于目前对于菌群基因库认知的不完全性，限制了对有关代谢物影响的理解。宏基因组测序为现有的基因提供了更深入的了解，但这些基因中的大多数功能仍然未知。为了进一步了解相关微生物菌群的功能潜力，可以进行微生物组+代谢组多组学联合分析，在了解微生物多样性的同时，探寻微生物对机体生化和功能的影响。上述几篇研究结合微生物组和代谢组多组学联合方法，构建了微生物与代谢组之间的网络关系，克服了单一组学研究的局限性，多角度理解微生物与代谢关系之间的联系，填补了微生物与代谢关系研究数据上的空白。您可能还喜欢：GeoChip助力中科院在地学类一级期刊发佳作！研究思路｜微生物组+代谢组多组学应用案例解读（第一期）研究思路｜三代宏基因组应用案例解读（第3期）

Nature子刊：专访微生物组研究最新技术Nature Methods[IF:28.467]① 技术是推动本领域发展的基石，本文专访了本领域正在研发中的多项新技术，助力大家把握好研究方向；② EcoFAB无菌体系实现可控人工微生物组研究对植物的影响，揭示因果；③ 基因组编辑工具来控制微生物群落的不同成员，结合设计微生物组环境以塑造微生物组；④ 肠道芯片用于在受控条件下探索人类宿主 - 微生物组相互作用；⑤ 人工设计合成使用不同压缩遗传密码的生物组成微生物组，限制微生物组水平基因转移等。Engineers embrace microbiome messiness【主编评语】微生物组的发展受益于相关技术的快速发展，让我们有能力研究微生物组这样复杂的对象。近年来Nature Methods、Nature Biotechnology基本每期都有宏基因组新技术突破，可见该领域研究的火热程度。Nature Methods编辑部采访了微生物组领域工程技术开发最前沿的几家实验室，为大家带来了正在开发中的新技术，它们将在进一步探索微生物组的复杂机制中大放异彩，同行值得仔细了解一下，想发大文章的，一定要结合自己实验室的优势，提前3-5年布局，不要再错过了风口。（@刘永鑫）Nature子刊：牛瘤胃微生物组的参考基因组集Nature Biotechnology[IF:31.864]① 瘤胃微生物组在反刍动物消化植物物质中非常重要，但大多数组分未被培养；② 基于283个牛胃样本获得6.5T二、三代测序数据，组装分箱得到4941个宏基因组组装基因组（MAG），同时鉴定了40多万个碳水化合物代谢相关的基因；③ 本文提出一种组装工作流程，可获得80％完整的细菌和古细菌基因组；④ 此参考基因集将宏基因组数据可比对率从15%的提高至50-70％，有助于更好地了解瘤胃微生物组的结构和功能。Compendium of 4,941 rumen metagenome-assembled genomes for rumen microbiome biology and enzyme discovery【主编评语】反刍动物为全世界数十亿人提供必需的肉、奶等重要营养。瘤胃是一种特殊的胃，适应植物来源的复合多糖的分解。瘤胃微生物组的基因组编码数千种适于消化植物物质的酶，它们主导反刍动物饮食结构。本文对近三百个牛胃样本进行宏基因组二、三代混合测序，获得了近五千个宏基因组组装的基因和40多万个碳水化合物代谢相关基因，为深入研究牛瘤胃微生物组提供了参考基因组，可进一步挖掘功能基因和筛选高转化效率菌种提供基础。同时也是近期第三篇Nanopare技术参与发表在自然生物技术杂志在宏基因组领域的文章，可见新技术在宏基因组中应用带来的巨大优势。（@刘永鑫）Nature子刊：宏基因组研究中取样和技术重复对时间和空间下物种丰度变化的影响Nature Methods[IF:28.467]① 一种基于重复采样和加内参(spike-in)测序的方法(DIVERS)可量化时间动态、空间采样和技术噪声对绝对细菌丰度的方差和协方差的贡献；② 应用DIVERS研究人体肠道微生物组时间序列和土壤细菌群落的空间变化；③ 在肠道中技术噪声主导了近一半分类群的丰度变异，揭示了微生物组的空间异质性以及拟杆菌门内的分类群的高时间协差；④ 在土壤群落中，空间变异主要导致短时间尺度（周）的丰度波动，而时间变化在较长时间尺度（几个月）占主导地位。Quantifying spatiotemporal variability and noise in absolute microbiota abundances using replicate sampling【主编评语】宏基因组测序已经能够对不同的微生物群落进行详细调查，但了解它们的时空变异仍然是一个重要的挑战。本文采用绝对定量、技术重复、不同取样部分的连续时间实验，经过方差分解法确定了各影响因素对不同丰度OTU丰度变化的影响大小，对我们研究中差异OTU的选择、丰度与差异可视度的关系、结果的评估有非常好的参考和借鉴意义。（@刘永鑫）Nature子刊：基于扩增子或宏基因组测序，预测菌群代谢组Nature Communications[IF:11.878]① MelonnPan是从菌群特征预测其代谢组的计算框架，给予模型上训练配对的代谢组和宏基因组，在新的菌群环境中预测潜在不可观察的代谢产物；② 将MelonnPan应用于两个独立的肠道宏基因组数据集，共220例受试者包括溃疡性结肠炎、克罗恩病和健康对照，在>50%的代谢产物中预测和观察到的菌群代谢趋势之间高度一致；③ 应用在珊瑚、鼠肠道和人阴道的微生物组的扩增子中，也保持相似的准确性；④ 还能提供预期性能评分，指导模型在新样本中的应用。Predictive metabolomic profiling of microbial communities using amplicon or metagenomic sequences07-17, doi: 10.1038/s41467-019-10927-1【主编评语】分析菌群代谢组有助于阐释菌群功能，但是对大规模样本进行代谢组学分析还是比较困难且昂贵的。Nature Communications近期发表一项研究，开发了一种算法，可通过机器学习，基于宏基因组或扩增子数据来预测菌群的代谢组，值得专业人士关注。（@李丹宜）Cell子刊：精准医疗中的菌群-药物互作（综述）Cell Host and Microbe[IF:15.753]① 单药物案例研究能够确定参与药物代谢转化的菌株及其代谢物，系统性筛选可对单菌株或多菌组合的药物代谢作用进行高通量检测；② 药物可影响菌群的生长和组成，也可被菌群代谢失活或转化从而起效或产生副作用；③ 菌群可与宿主免疫系统互作或代谢药物，直接或间接的影响免疫调节药物的活性；④ 抑制微生物酶、消除特定菌株、引进新菌株、菌群的遗传修饰，可实现对菌群的精确干预，提高药物疗效；⑤ 了解菌群如何影响药物疗效将有助于精准医疗。Precision Medicine Goes Microscopic: Engineering the Microbiome to Improve Drug Outcomes【主编评语】菌群与药物的互作可影响药物治疗效果，Cell Host and Microbe今年7月刊发的“微生物与药物”专刊中，这篇综述详细探讨了菌群-药物互作研究领域的进展，以及用于改善药物疗效的菌群干预策略，值得专业人士参考。（@李丹宜）影响高血压的饮食-菌群-免疫互作（综述）Cardiovascular Research[IF:7.014]① 肠道菌群失调可能通过影响免疫细胞的分化和活性引发炎症状态，影响实验性高血压的发生发展，并可能在临床高血压的发病中起作用；② 富含高纤维饮食在肠道菌群作用下生成短链脂肪酸，特定短链脂肪酸有助于减少炎性因子、降低血压、改善心脏功能；③ 高血压患者的G偶联蛋白受体可能是联结饮食-菌群-宿主免疫系统的中心环节；④ 高脂、少纤维或高盐的西方饮食可抑制有益的肠道共生菌、激活促炎的免疫反应，引起血压升高。The effect of diet on hypertensive pathology: is there a link via gut microbiota-driven immune-metabolism?【主编评语】菌群-免疫在高血压中的作用广受关注。Cardiovascular Research近期发表综述文章，回顾了现有研究对肠道菌群、饮食和免疫系统在高血压形成中的作用及其参与血压调节的可能机制，尤其强调了饮食调控在治疗、缓解高血压中的作用，值得参考。（@小肠君）农大张燕：生命早期补充叶绿素调节小鼠菌群并预防肥胖Molecular Nutrition and Food Research[IF:4.653]① 生命早期补充叶绿素，可有效阻止高脂饮食（HFD）喂养小鼠的体重增加，改善葡萄糖耐量，减少低度炎症；② 补充叶绿素能够逆转HFD诱导的肠道菌群失调，降低厚壁菌门/拟杆菌门比值；③ 与HFD小鼠相比，叶绿素干预后，劳特氏菌属和拟杆菌目-S24-7菌属丰度增加，乳球菌属和乳杆菌属丰度降低，提示叶绿素可能通过调节肠道菌群组成来改善肥胖相关指标；④ 生命早期摄入叶绿素有利于进行健康的体重管理，并对随后的年龄相关性肥胖产生有益影响。Chlorophyll Supplementation in Early Life Prevents DietInced Obesity and Molates Gut Microbiota in Mice【主编评语】来自中国农业大学的张燕团队在Molecular Nutrition and Food Research上发表的一项最新研究，发现高脂饮食喂养小鼠在生命早期补充叶绿素后，可显著降低体重增加，并改善肠道菌群组成及肥胖相关指标。（@沈志勋）台湾学者：特定乳杆菌或可抑制幽门螺杆菌感染Journal of Clinical Medicine[IF:5.688]① 鼠李糖乳杆菌（GMNL-74）和嗜酸乳杆菌（GMNL-185）对多重耐药幽门螺杆菌具有较强的抗菌活性；② 细胞试验中，两株乳酸菌均可显著降低幽门螺杆菌对胃上皮细胞的粘附和侵袭作用，并降低宿主细胞IL-8的产生；③ 小鼠实验中，两株乳酸菌能减轻幽门螺杆菌的定植和由此引起的胃部炎症；④ 在感染了幽门螺杆菌的小鼠中，摄入GMNL-74和GMNL-185可显著增加小鼠肠道中的益生菌丰度，包括双歧杆菌属和Akk细菌Akkermansia muciniphilia。Probiotic spp. act Against -inced Inflammation【主编评语】来自中国台湾多所机构的研究人员近期在Journal of Clinical Medicine发表研究，在细胞实验和动物模型中均发现，鼠李糖乳杆菌（GMNL-74）和嗜酸乳杆菌（GMNL-185）可抑制幽门螺旋杆菌的致病性，并调节肠道菌群结构。该结果有助于开发新的幽门螺杆菌治疗方法。（@小肠君）您可能还喜欢：GeoChip快速高效检测城市流域的抗生素抗性基因研究思路｜高通量qPCR芯片检测+微生物多样性应用案例解读

人类微生物组研究设计、样本采集和生物信息分析指南A guide to human microbiome research: study design, sample collection, and bioinformatics analysisChinese Medical Journal [IF: 1.585]DOI: https://doi.org/10.1097/CM9.0000000000000871Review: 2020-6-26钱旭波1, 陈同2, 徐益萍1, 陈雷3, 孙馥香4, 卢美萍1, 刘永鑫5,6浙江大学医学院附属儿童医院风湿、免疫和变态反应科中国中医科学院中药资源中心首都医科大学附属复兴医院易汉博基因科技（北京）有限公司中国科学院遗传与发育生物学研究所中国科学院大学，生物互作卓越创新中心钱旭波和陈同为共同第一作者通讯作者：卢美萍，浙江大学医学院附属儿童医院风湿、免疫和变态反应科，中国浙江杭州竹竿巷57号，邮编：310003，邮箱：meipinglu@zju.e.cn摘要这篇综述的目的是为医学研究人员，特别是那些没有生物信息学背景的研究者提供简单易懂的微生物组学知识，包括研究中常用的概念、技术和分析方法等。首先，我们介绍了基本概念，例如微生物群（microbiota）、微生物组（microbiome）和宏基因组（metagenome）等。然后，我们讨论了研究设计方案、样本量计算方法以及提高研究可靠性的方法。我们特别强调了阳性和阴性对照的重要性。接下来，我们讨论了微生物组研究中常用的统计分析方法，重点关注多重比较的问题以及组间β多样性分析的方法。最后，我们介绍了生物信息学分析的具体流程。总之，严谨的研究设计是获得有意义结果的关键步骤，而适当的统计方法对于准确解释微生物组数据很重要。通过阅读这篇文章，研究者能获得研究设计、样本采集和生物信息分析等全方位的微生物组学知识。关键词：微生物组、研究设计、统计分析、样本量、生物信息分析、分析流程1. 前言随着测序技术和数据分析方法的发展，近几年医学微生物组研究领域出现了一些令人瞩目的成果[1-3]，比如微生物组与代谢性疾病[4-6]、消化系统疾病[7-10]和心血管系统疾病[11]之间的关系日益明确。这些发展和发现增加了医生在微生物组研究方面的兴趣，进而也涌现出了大量有价值的论文[12]。另外，随着QIIME 2[13]和多组学方法[1, 9]等先进技术和分析流程的出现，微生物组分析方法也不断进步。然而，理解和掌握这些技术和分析流程并非易事，特别对于医生来说更是如此。本文的目的是为研究者，特别是那些没有生物信息学背景的医生提供易懂的微生物组学知识，这些知识包括详细的微生物组学基本概念、科研设计方法、样本采集和保存方法、统计分析方法以及生物信息分析方法。我们希望医生们通过阅读此文能够快速掌握以上知识和方法，进而有效地挖掘数据背后的生物学意义。2. 基本概念2.1 Microbiota、Microbiome等术语Microbiota(微生物群/微生物组)是指定植在人体特定部位的微生物，包括细菌、古菌、病毒、真菌和原生动物[14, 15]。在医学研究中，如果测序技术采用的是16S rRNA基因（又称为rDNA），则microbiota是指细菌和古菌。Microbiome是指整个微生境，包括微生物、基因组和周围环境[14, 15]。不过，microbiota和microbiome有时存在混用情况。我们建议，如果你的研究仅涉及微生物本身，则应该使用microbiota，否则应该使用microbiome（图1）。例如，如果研究者想探索肠道短链脂肪酸与微生物的关系，使用microbiome更合适。宏基因组（metagenome）是指微生物基因组的集合[14]，一般用鸟枪法宏基因组测序获得，宏基因组学则是研究宏基因组的学科[12, 14]。病毒组（virome）指人体内或表面的病毒集合，包括内源性逆转录病毒、真核生物病毒和噬菌体[16]。研究病毒组的学科就是病毒组学。作者注：Microbiota国内有些学者翻译为“微生物群”，microbiome翻译为“微生物组”。不过中文文献用“微生物组”或“××菌群”即可，多数情况下不需要区分是microbiota或microbiome。图1：微生物组、微生物群、宏基因组和16S rDNA的概念。（A）微生物组（microbiome）的概念不仅涵盖微生物，而且涵盖周围的环境条件。微生物群（microbiota）仅指微生物本身。（B）宏基因组是指微生物的所有基因组，而16S rDNA仅涵盖基因组的一部分。（C）α多样性衡量样本中的多样性，而β多样性比较样本之间的物种差异。2.2 细菌层级分类细菌分类最常用的层级为门、纲、目、科、属、种、株。例如，临床上十分常见的大肠埃希菌的层级分类见表1。表 1: 大肠埃希菌细菌层级分类2.3 操作分类单元和扩增子序列变异操作分类单元（operational taxonomic units，OTUs）的构建对于标记基因（扩增子）数据分析非常重要[17]。OTU是指一组高度相似的序列，通常将具有97%相似性的一组序列归为一个OTU[18, 19]。不过，这种OTU的方法有显著的缺点，它人为地设置一个相似性阈值，漏掉了细微的和真正的生物学序列差异[20]。最近开发的扩增子序列变异（amplicon sequence variants, ASVs）方法可以解决这些问题，它使用序列变异信息将序列数据解析为准确的序列特征。ASV具有单核苷酸分辨率，并且具有比OTU相似或更好的敏感性和特异性[20]。注意，OTU或ASV不等于物种，一个OTU / ASV可能包括多个物种，反之亦然[21]。2.4 α-多样性α-多样性是指样本内的多样性，常见的样本有粪便，唾液或支气管肺泡灌洗液等[15]。医学研究中经常使用3种α多样性指数：Chao 1指数、香农指数和辛普森指数。Chao 1指数主要反映物种数量（richness），它计算时考虑以下三个因素：物种数量、单条序列数量和双条序列数量[22]。这意味着它不能反映微生物组的丰度（abundance）。香农指数结合了丰度和均匀度信息[23]，它赋予稀有物种更多的权重[22]，这意味着当稀有物种的数量增加时，它的值会更大。香农指数的值通常不超过5.0；它的值越高，α多样性就越丰富[22]。辛普森指数也整合了丰度和均匀度，不过与香农指数比较，计算时它对常见物种有更大权重。它的值介于0-1之间，这个值越大，α多样性越丰富[22]。在以上指数中，richness是指一个样本中物种的数量[17, 24]，而abundance（丰度）指物种的原始序列读数[24]。如果原始序列读数被转换成百分比后，它就称为相对丰度。2.5 β-多样性β-多样性是指样本或组间的微生物组差异，通常用于了解两组微生物组组成的差异是否显著。在这里，我们关注两个常用的β多样性指数：Bray-Curtis相异性和UniFrac距离。Bray-Curtis相异性是一种用于量化两个样本或组间的物种组成差异的指标，其值的范围是0到1，其中0表示两个样本或组间具有相同物种，而1则表示它们不共享任何物种[25]。此外，它在计算时给予常见物种更大的权重[23]。请注意，Bray-Curtis相异性不是真正的距离度量指标，因此用“Bray-Curtis相异性”的叫法比“Bray-Curtis距离”更恰当[22]。UniFrac距离可以不加权，也可以加权，它基于系统发育距离估算微生物组样本或组间的差异[26]。未加权的UniFrac距离只考虑了物种是否存在，它对于检测稀有物种的数量变化很敏感，但是在计算中忽略了丰度信息[27]。加权UniFrac距离计算时纳入了丰度信息[28]，并减少了稀有物种的权重[29]。2.6 排序排序用于探索数据结构，由降维后的正交轴图形表示。排序图是可视化β多样性的有效方法。排序可以分为2大类：非约束排序和约束排序[30-32]。如果图形上的点不受环境因素（样本元数据）的约束，这种排序叫做非约束排序，否则叫约束排序[32]。常用的非约束标准包括主成分分析（principal component analysis, PCA）、对应分析（correspondence analysis, CA）、主坐标分析（principal coordinate analysis, PCoA）和非度量多维标度（non-metric multidimensional scaling, NMDS）[30, 32]。常用的约束排序有冗余分析（rendancy analysis, RDA）和典范对应分析（canonical correspondence analysis, CCA）[31, 32]。微生物组信息是高维数据。PCA通过将数据以几何方式投影到较少的维度上来简化复杂性，它在计算中使用欧几里得（Euclidean）距离[30]。通常情况下它并不适用于物种丰度数据的分析，因为PCA分析的数据必须是线性的[30]。但是如果物种数据经过Hellinger转换，则PCA可以用于物种数据分析[30]。相反，CA适合于物种丰度数据分析，而且无需预先转换数据。在CA分析中，所有样本均使用Pearson卡方距离进行排序[30]。但是请注意，稀有物种可能会对CA分析产生过大影响[33]。如果研究人员希望基于相异性指标来对样本或特征进行排序，那么PCoA是一个不错的选择。在微生物组研究中，PCoA分析最常使用Bray-Curtis相异性和UniFrac距离。NMDS用于表示排序图中样本的相对位置。与PCoA相似，NMDS分析可以使用任何距离或相异矩阵。参考文献[30]详细介绍了PCoA和NMDS之间的差异，在大多数情况下PCoA比较常用。RDA是一种结合了PCA和回归的约束排序，它的响应矩阵是微生物组数据，解释矩阵是临床指标（样本元数据）。RDA对于显示微生物组数据是否受临床指标影响很有用。但是请注意，由于PCA计算过程要求响应矩阵的数据结构必须是线性的，因此可能需要对数据进行预转换。最后，CCA其实就是CA的约束版本，它具有CA的基本特性和缺点[31]。3. 研究设计3.1 研究设计方案严谨的研究设计对于获得准确而有意义的结果很重要。医学微生物组研究中最常使用的研究方法包括横断面研究、病例对照研究、纵向研究和随机对照试验（randomized controlled trial, RCT）。前3种是不应用干预因素的观察性研究，而最后一个是典型的实验性研究。横断面研究分为描述性横断面研究和分析性横断面研究[34]。前者仅是描述性的，主要用于调查一个或多个人群中的微生物组成，而后者则用于探讨微生物组与健康结果之间的关联。但是，微生物组与健康结果之间的关联可能源于混杂因素，例如性别[35]、年龄[36]、体重指数（body mass index, BMI）[37]、饮食[5, 38]、季节[39]和药物治疗[40, 41]。此外，横断面研究时，微生物组和结果是同时测量的，因此很难确定它们之间的因果关系。通常，横断面研究仅用于探索微生物组的基本特征，并且可以作为后续研究的初步实验。在大多数情况下，微生物组被视为暴露（exposure），疾病被视为结局（outcome）。在这些假设下，传统的病例对照研究很少用于微生物组研究，因为以前的暴露（微生物组）信息很难获得。但是，如果暴露和结局对调，则可以使用病例对照研究设计方案。同样，在上述假设下进行前瞻性队列研究也很困难，因为很难知道哪些微生物是潜在的暴露。而且，定义可用作暴露或非暴露因素的特定微生物组并非易事，因此难以将研究对象确定为暴露或非暴露个体。在实践中，有或没有疾病的个体通常归入研究组或对照组，然后在不同时间点前瞻性地收集含有微生物组的样本[17]。也就是说，前瞻性队列研究中的研究对象通常根据临床结局而不是特定的微生物组模式进行分组。RCT或其他实验研究的目的是评估干预措施的有效性。干预措施可以是药物或微生物组。例如，粪菌移植研究中的干预措施是微生物群[42, 43]。值得注意的是，对照组的选择应恰当。以上这些研究设计中应注意匹配混杂因素，这部分内容将在下面讨论。有时对照的选择很困难，尤其是在临床研究中干预措施是微生物群本身的情况下。在这种情况下，如果其他研究设计不合适，那么进行有对照组的前后自身对照试验（controlled before-after trial）或历史对照试验将是一个不错的选择[44]。3.2 定义纳入和排除标准定义确切的纳入标准和排除标准可以使组间更好地匹配，并且有利于控制混淆因素，比如年龄[36, 45]、性别[35]、BMI[46]、饮食[47]、季节因素[39]、药物治疗[40, 41]、种族[48]、地理区域[45]和共存疾病等[7]。年龄可显著影响微生物组，对于那些小于16岁的人更是如此[36, 45]。因此，对于涉及儿童的研究，年龄必须很好地匹配。饮食是另一个对微生物组改变有影响的因素，所以也要进行匹配[47]。为了增加组间的可比性，地理区域因素在研究设计时也需要考虑在内[45]。由于药物治疗对于微生物组有显著影响，所以入组前数月内接受过药物治疗的患者应该排除在外[41, 49]，这里讲的数月通常指入组前3~6个月[49]。3.3 微生物组研究的样本量和检验效能计算在进行研究设计时估计样本量大小非常重要。适当的样本量可使微生物组研究识别出组间的差异，并节省资源和时间。但是，样本量和检验效能计算对于研究者来说仍然是一个挑战[50]。微生物组研究中最常用的样本量和效能计算方法可以用t检验、方差分析、χ2检验和Dirichlet多项式模型[51]。以t检验为例，分3个步骤确定样本大小和效能计算。首先，通过初步实验获得少量扩增子数据。其次，使用R包vegan计算出每个样品的香农指数[52]。最后一步是使用R软件包pwr中的power.t.test()函数计算样本量和效能。当研究者仅关注两组之间物种多样性的差异时，可使用t检验计算样本量和效能。在参考文献[51]中有样本量和效能计算的详细介绍。3.4 阴性和阳性对照的重要性微生物组研究的结果可能会受到多种因素的影响，例如DNA提取试剂盒、采样方法、污染和测序方法等[53]，不过可以通过使用阴性和阳性对照来减少这些影响。不幸的是，以前的研究中只有30％报告使用了阴性对照，只有10％报告使用了阳性对照[53]。使用对照对于准确认识微生物组非常重要，尤其是当样本的微生物含量较低时。以前的研究发现，过去被认为是无菌的标本（例如胎盘和关节液）可能会被微生物定植[54]。但是，这些阳性的结果可能是由其他因素导致的，例如污染。有趣的是，这些低生物含量标本在采用阴性和／或阳性对照后已被证明是无菌的[55]。因此，我们建议当样本为低生物含量样本（例如血液、羊水、脑脊液、关节液和胎盘等）时，应考虑使用阴性和阳性对照。值得注意的是，阴性对照和阳性对照在病毒学研究中也很重要，因为病毒和细菌通常是同时进行检测的[16]。此外，R包decontam可用于鉴定和去除扩增子和宏基因组学数据中的污染物序列[56]。3.5 测序方法的选择微生物组研究中使用的测序方法包括扩增子测序、宏基因组测序和宏转录组测序。扩增子测序包括适用于细菌和古菌的16S rDNA测序以及适用于真菌的内部转录间隔区（internal transcribed spacer, ITS）测序。每种测序方法的优缺点在这两篇参考文献中有详细讨论[17, 57]。简而言之，扩增子测序很便宜，可应用于受宿主DNA污染的低生物含量标本，但一般仅能注释到“属”层级，并且易受某些固有偏倚来源的影响，例如PCR循环数[58]。宏基因组测序方法对样品中存在的所有DNA进行测序，包括细菌、病毒、真核生物和宿主的DNA。它不仅将其分类学分辨率扩展到“种”或“株”的水平，而且还提供了潜在功能信息[17]。但是，扩增子和宏基因组测序方法都无法区分死微生物或活微生物[17]。转录组测序仅产生群落的活跃功能信息。鉴于这些测序方法的优缺点不同，建议将多种测序方法整合在一起以优化研究设计。简而言之，测序方法的选择主要取决于实验成本和样本质量。扩增子测序通常用于获得微生物群落的概况[59]，并且通常适用于大规模研究[6, 60]。如果您有足够的项目资金，并且想要获得菌株水平的分辨率和潜在功能，甚至想要恢复整个基因组，宏基因组测序是一种首选方法[61-65]。3.6 提高研究可靠性的方法简单的横断面研究在微生物组研究中的意义有限。在本小节中我们讨论了提高研究可靠性的方法。首先，首选纵向研究或RCT研究，而不是横断面研究或病例对照研究[17, 66]。其次，应计算样本量[51]。第三，混淆因素应匹配，元数据（即各种临床指标等信息）应仔细收集。第四，应详细定义纳入和排除标准。例如，幼年特发性关节炎有几种亚型，每种亚型可能代表不同的疾病[67]。研究者应确定患者组中是否包括所有亚型。第五，最好考虑使用阴性和/或阳性对照[68]。第六，整合其他组学方法，例如代谢组学、转录组学和蛋白质组学，这对于全面了解微生物群落的结构和功能至关重要[17]。因此，应考虑获取微生物群落代谢物概况和／或其他多组学数据。目前，仅探索微生物群落结构的研究不被视为论证效率强的研究设计[17]。最后，建议在动物模型中验证从临床试验获得的初步结果。表2列出了设计临床微生物组研究需要考虑的因素，图2展示了典型的工作流程。实验研究需要考虑的因素见参考文献[49]。表 2: 临床微生物组研究设计需要考虑的要素核对表RCT：随机对照试验4. 样本类型、保存和储藏4.1 样本类型人类微生物组研究的样本类型包括粪便、结肠灌洗液和腔内刷等（表2）。样本类型的选择取决于感兴趣的研究假设。例如，粪便样本易于收集，可用于大规模和纵向研究。另一方面，活检样本对于探索微生物群与宿主之间的相互作用更有用[69]。注意，在一项研究中应该固定采样位置，因为人体的不同部位定植着不同的微生物群[70, 71]。图2：人类微生物组研究的典型流程。4.2 保存和储藏样品保存和储藏的方法应适合实验方法和样品类型。最通用的方法是直接冷冻样品，它可用于各种测序和实验方法，例如扩增子、宏基因组、转录组测序和代谢组学测定。建议将样品收集后15分钟内保存在-20℃下[72, 73]，然后在收集24小时内用干冰转移到-80℃冰箱中储藏。不过样本通常是在家里而不是在医院收集的，在这种情况下可以使用保存液。保存液中保存的样本可以在环境温度下保存一周以上[74]。请注意，样品的保存和储藏方法应一致，以最大程度地减少潜在的混淆因素干扰。5. 微生物组研究中的统计分析方法医学研究者通常熟悉单变量统计方法，例如t检验、方差分析、χ2检验和秩和检验。因此，我们在这里仅讨论与多重比较和其他多元统计方法有关的问题。我们首先讨论多重比较会遇到的问题及其解决方案，包括P值调整和使用错误发现率（FDR）。然后，我们讨论其他多元统计方法，例如置换多元方差分析（permutational multivariate analysis of variance, PERMANOVA）和Mantel检验。5.1 多重比较的问题及解决方法由于微生物组数据是高维的，因此多重比较经常在微生物组研究中使用。例如，特征表（feature table）具有成百上千个OTU或ASV，并且每个OTU或ASV都可以进行多次比较。医学研究者经常遇到的另一个例子可能更容易理解。假设一项研究分为3组，例如A组、B组和C组，而研究者想比较这3组之间的差异。在这种情况下就应调整P值，因为每个组都进行了2次比较，即A组与B组，A组与C组，B组与C组。如果有任何组或变量需要进行多次比较则必须进行P值调整，以便减少假阳性率[75]。调整P值的经典方法是控制family-wise错误率，即Ⅰ类错误或α水平。Bonferroni是校正α水平最常用的方法。校正P值的计算非常容易：单个检验的α值除以检验次数。因此，对于上述具有3个检验次数的例子，调整后的P值为0.05 / 3 = 0.017，即只有P <0.017的检验结果才被认为是有意义的[75]。请注意，Bonferroni校正仅适用于多重比较次数较少的假设检验，否则会导致较高的假阴性率（图3）[75]。解决多重比较问题的另一种方法是控制错误发现率（false discovery rate, FDR），它是I类错误或假阳性的数量与所有被拒绝的无效假设的预期比例。例如，如果100个阳性假设检验结果中有5个是错误发现，则FDR为5％。在微生物组研究中，通常使用“Benjamini-Hochberg（BH）校正的P值”而不是原始P值。校正后的P = 原始P * m/i，其中m是检验次数，i是每个P值从小到大排序的序号[75]。如果校正后的P值小于你选择的所选FDR，则认为该检验是有统计学意义的。与Bonferroni方法相比，BH方法不那么保守（即校正强度不是很大），BH法通常用于微生物组特征的多重比较。Bonferroni和BH是最常用的P值校正方法[76]，这两种P值校正方法的校正强度见图3所示。图3：不同P值校正方法的校正强度该图显示，Benjamini-Hochberg校正强度小于Bonferroni。随着原始P值的增加，Bonferroni校正法生成的校正后P值快速接近1.0。5.2 PERMANOVA检验有几种统计方法或模型可以用于组间β多样性比较，比如PERMANOVA、Mantel检验、相似性分析（ANOSIM）和多响应置换程序（multi-response permutation proceres, MRPP）。PERMANOVA最常用，并且被认为是以上检验方法中检验效能最大的一种[77]，它可通过R包vegan中的函数adonis()实现[52]。vegan包可计算4种常用相异性或距离度量：Bray-Curtis相异性、Jaccard距离以及加权和未加权UniFrac距离[29]。如果PERMANOVA检验的P值小于0.05，则表明不同组间的β多样性差异具有统计学意义；该检验的另一个输出结果是R2，它表示总方差可以用分组因素来解释的比例[29]。5.3 Mantel检验Mantel检验通常用于分析元数据矩阵和微生物组矩阵之间的关联[77]，它可使用R包vegan中的mantel()函数实现[52, 77]。该检验的输出至少2个主要统计量：P值和r。与其他类型的相关系数类似，r的值范围是-1 ~ +1[29]。例如，假设研究人员想知道元数据种的分组因素（例如吸烟状态）是否对肠道微生物组的组成产生影响。如果P＜0.05并且r＞0，这表明吸烟组和不吸烟组之间肠道微生物组的组成不同，元数据矩阵和微生物组矩阵呈正相关。6. 生物信息分析6.1 扩增子数据分析：从原始数据到物种分类表有几种流行的软件或分析流程（pipeline）可用于扩增子数据分析，例如QIIME 2[13]、USEARCH[78]、VSEARCH[79]和mothur[80]。前两者具有许多优点，并已被许多研究者使用和推荐。每种软件或分析流程的优缺点已在我们先前的论文中详细描述[81]遗传：微生物组数据分析方法与应用 和 Protein Cell：扩增子和宏基因组数据分析实用指南。扩增子分析的主要步骤见图4A。我们通常从fastq格式的原始双端Illumina数据开始，最终输出是一个特征表，也称为OTU表或ASV表。第一步是从原始数据中恢复纯净的扩增子序列，因为原始数据包括人造序列产物（artifact），例如引物和标签（barcode）。它包括3个主要过程：合并双端序列，通过标签拆分序列和去除引物。由于原始数据没有统一的标准格式，因此我们需要设计适合上述过程的分析流程。另外，我们也可以使用基因测序公司提供的纯净扩增子数据。图4B显示了用于恢复纯净扩增子序列的典型分析流程。第二步是滤除低质量序列，以便减少背景“噪音”。第三步是识别非冗余序列并且计数。高质量序列仍然有许多人造序列产物，例如错误序列和嵌合体。非冗余序列的计数是找出可靠序列的关键信息。第四步是选择代表性序列（特征）。此步骤基于唯一序列，并通过将序列聚类成OTU或降噪生成ASV来实现[18, 82]。此步骤还包括de novo检测和去除嵌合体。第五步是有参嵌合体检测，这是可选项[83]。通过将序列比对到数据库中，例如rRNA数据库SILVA[84]，可以进一步过滤特征序列。应当指出的是，该步骤可以降低假阳性率但易于导致假阴性结果。最后，通过将纯净的扩增子数据与特征序列进行比较来生成特征表（图4A）。然后使用基于RDP[85]、SILVA或Greengenes[86]数据库的分类器实现特征序列的物种分类。此外，基于16S rRNA基因谱，使用PICRUSt[87, 88]、FAPROTAX[87, 89]和BugBase[90]等工具可实现功能预测。6.2 宏基因组分析：从原始数据到物种和功能分类表扩增子测序仅能获得微生物组部分的分类学信息，而且PCR过程很容易产生偏倚和嵌合体[83]。鸟枪宏基因组测序比扩增子测序提供更详细的基因组信息和更高的分类学分辨率[66]。与扩增子方法相比，宏基因组学分析更为复杂，但是它提供了更准确的物种分类、多维度的功能信息，甚至是末培养微生物的基因组草图。宏基因组分析流程如图4C所示。第一步是预处理原始序列数据。原始数据包含低质量的污染序列以及与宿主相关序列。我们可以使用FastQC软件（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/ projects/fastqc/）进行数据质量检查，然后使用KneadData流程进行质量控制[91]并去除宿主DNA[92]。有关更多KneadData的信息，请访问 http://huttenhower.sph.harvard. e/kneaddata 。第二步是使用基于序列的方法分析物种分类和功能代谢特征。人类微生物组具有高质量的基因集（gene catalog）和基因组[64, 65]，因此我们建议使用HUMAnN2[93]工具并采用基于序列的方法进行物种分类和代谢通路分析，该方法高效且易于操作。但是，这种方法只使用一小部分序列信息，而且分析结果受到已知数据库的限制[66]。如果需要发现新物种或基因功能，则需要进行第三步。有几个好的软件工具可以用于将纯净序列组装为重叠群（contigs），例如MEGAHIT[94]和metaSPAdes[95]。然后通过MetaProdigal[96]或Prokka[97]从长序列中预测基因。另外，其他软件工具也可以用于从短序列中预测编码基因，例如MetaGeneAnnotator[98]、MetaGeneMark[99]、Glimmer-MG[100]、MetaGUN[101]、FragGeneScan[102]和Orphelia[103]。为了减少重复基因，在分析多个样品或批次时需要使用CD-HIT构建非冗余基因集[104]。通过采用Bowtie 2[92]或Salmon[105]工具进行比对的方法可以计算基因丰度。目前至少有20个软件工具可用于宏基因组数据物种分类[106]。我们建议使用超快速分类器Kraken 2，它可以提供快速、准确和“种”级别的分类结果[107]。至于功能注释，许多研究人员都推荐使用DIAMOND[108]，它是一种快速、敏感的蛋白质比对工具[108]。每个数据库都提供了独特的功能视角，例如，京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）[109]、EggNOG（一个提供直系同源关系、功能注释和基因进化历史的数据库）[110]、碳水化合物活性酶数据库（Carbohydrate-Active enZYmes Database, CAZy）[111]、致病菌的毒力因子（Virulence Factors of Pathogenic Bacteria, VFDF）[112]和综合抗生素抗性数据库（Comprehensive Antibiotic Resistance Database, CARD）[113]。宏基因组通常包含100~1000个物种[64]，很难厘清彼此关系。分箱算法可以恢复无法培养的高丰度菌的基因组草图，并重建系统发育和代谢通路。最后一步是使用metaWRAP[114]或DASTool[115]执行分箱流程（图4C）。这些软件工具有逐步操作教程，并且在其网站上提供了有关人类微生物组的一些样本数据集[81]。另外，几个集成的分析流程，例如MOCAT 2[116]、bioBakery[98]、IMP[117]和微生物组助手（Microbiome Helper）[118]，可以执行上述部分或全部分析步骤。你可以在微信公众号“宏基因组”中找到一些受欢迎软件的中文教程。现在你已经获得了物种分类和功能信息文件。通过STAMP或LEfSe可以轻松找到你感兴趣的生物标记[119, 120]。使用R语言或ImageGP（http://www.ehbio.com/ ImageGP）可以将所有结果可视化。图4：人类微生物组研究的生物信息学分析流程（A）扩增子数据分析的主要步骤。（B）扩增子数据预处理的典型流程图：从原始的双端序列到纯净的扩增子。（C）宏基因组测序数据的分析流程。（a）预处理。它涉及删除低质量序列、接头和宿主序列。输出文件是纯净序列。（b）基于序列的分析。它将序列与数据库比对来推断物种分类和代谢特征。（c）基于组装的分析。它将短序列组装为长序列，预测基因，构建非冗余基因集，并与数据库比对进行物种分类和功能注释。（d）分箱。它涉及恢复未培养微生物的基因组草图，并重建系统发育和代谢通路。KEGG：京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）；eggNOG：基因进化谱系：非监督直系同源群（Evolutionary genealogy of genes: non-supervised orthologous groups）；CAZy：碳水化合物活性酶数据库（Carbohydrate-active enzymes database）；CARD：抗性基因综合数据库（Comprehensive antibiotic resistance database）；VFDB：毒力因子数据库（Virulence factor database）。7. 病毒组在人类疾病中的作用近年来病毒组在人类疾病中的作用吸引了医学研究者的关注[121]。使用病毒组学的方法已发现了许多令人信服的研究成果[122]，其中一些技术已经用于临床[123]。在微生物组研究中，病毒组学与其他多组学方法整合后显示出广阔的应用前景。但是，病毒组学研究仍然面临一些挑战。例如，至少40％的病毒序列无法注释[124]。此外，病毒的测序结果容易受到背景噪音的影响[17]。最后，很难获得用于病毒组研究的商业化阳性对照，即病毒模拟群落[16]。8. 总结和结论本文讨论了用于微生物组研究的研究设计、样本收集、统计方法和生物信息学分析方法。在“研究设计”部分，我们强调了研究设计的重要性，特别是设计方案、样本量计算以及用于提高研究可靠性的多种措施。研究设计非常重要，因为不好的研究设计可能会产生无意义的数据。在“统计分析”部分，我们介绍了详细的多重比较P值校正方法。选择合适的统计方法对于准确解释微生物组数据很重要。最后，“生物信息学分析”部分介绍了用于分析微生物组数据分析的方法。本文图中使用的脚本可从 https://github.com/YongxinLiu/Qian2020CMJ 获得。综上所述，对于微生物组研究而言，严谨的研究设计在获得有意义的结果方面具有举足轻重的作用，而适当的统计方法对于准确解释微生物组数据非常重要。循序渐进的分析流程为研究者掌握最新生物信息学分析方法提供了帮助。参考文献略，详见原文Xu-Bo Qian, Tong Chen, Yi-Ping Xu, Lei Chen, Fu-Xiang Sun, Mei-Ping Lu & Yong-Xin Liu. (2020). A guide to human microbiome research: study design, sample collection, and bioinformatics analysis. Chinese Medical Journal Publish Ahead of Print, doi: https://doi.org/10.1097/cm9.0000000000000871相关文章Protein Cell：扩增子和宏基因组数据分析实用指南遗传：微生物组数据分析方法与应用刘永鑫：想学菌群生物信息分析-21分钟带你入门

五年级科学教材大象版有多少一课《人类的朋友》，是探究酵母菌的，其中有一个探究显微镜下的酵母菌。科学老师在培养皿里注入一些温水30-36摄氏度，倒入适量的白糖或者面粉融化作为培养液。取一些培养液涂抹在载玻片上，盖上盖薄片，放在显微镜下，压好，调试好目镜和物镜，物镜下面的聚光镜一定要对准太阳，或者用小手电筒代替聚光镜也可以。在这节课上全班学轮流不但看到了酵母菌，还看到了朱浩然同学唾液中的消化酶。老师用手机拍了显微镜下微生物的照片，把它发到班级微信群里，你看：显微镜下的jiaomujun老师还准备带领学生看看自己的血液、青霉菌、黄曲霉菌，做好图文和视频记录，播报给大家。显微镜真的很好！

美国顶尖的医疗机构克利夫兰医学中心于2016年10月公布了“2017年十大医疗科技创新”的榜单，基于人体微生物组的预防、诊断和治疗，位居榜单第一位。随着科技进步和人们对健康的关注，人体微生物组研究已逐步从实验室走向市场。本期，理中归元与大家分享的是肠道微生物组学发展带来的新兴产业。一、微生物组检测健康管理前几年美国联邦政府发表声明，每年投入4亿美元，实施“国家微生物组计划”（NMI），在内部多家机构的帮助下，将尝试在未来绘制并研究这些微生物的组合。加上社会每年10亿美元投入，现在美国联邦政府每年有14亿美元的资金应用于微生物组的研究。人体微生物组菌群就像人体健康的“晴雨表”，菌群成分的变化可以在人体内环境层面反映人体的健康特征。微生物组检测技术为健康管理行业的发生和发展创造了可行性。自2001年人体基因组计划(HGP)完成以来，针对个体基因组的密集研究在过去十五年间未间断，诸如靶向治疗以及非侵入式产前诊断等相关应用使得个体基因组产业保持着超过10% 的高速年增长率。微生物检测组是近几年兴起的一个概念，美国在这个领域比较早期的公司Ubiome成立于 2012年底，获得了几轮数百万美元的融资。虽然在过去几年中的火爆程度不及个人基因组检测，但随着“国家微生物组计划”（NMI）的实施，微生物组的商业化前景肯定要超越个人基因组检测。微生物组检测是检测身体的不同部位，比如口腔、肠道、皮肤等部位的微生物变化，对身体健康进行实时监测，通过比较微生物变化来提醒客户应该吃点什么食物或者应该多做些什么运动。理中归元通过查阅资料总结其他相关的公司及研究成果：Arivale公司通过了解客户的基因、血液、唾液及肠道微生物组等指标，制定相关计划（作息、运动及饮食等），促进人体健康；AMI公司是一家非营利性机构，致力于微生物科学与教育，通过微生物组学研究促进人体健康。二、体外诊断我国微生物学诊断领域起步较晚，受制于国内生物医学和机电一体化应用落后于国际水平，国内微生物学诊断发展一直比较缓慢，培养基种类不多，需求基本要依赖进口满足。我国微生物学诊断与国际水平差距较大，不过华大基因近期在此领域突破较为明显：2012年，华大基因II型糖尿病（T2D）和肠道菌群联系的研究成果发表在Nature上，该研究发现了众多T2D基于肠道菌群的疾病诊断预测标记物，利用这些标记物可很好地在验证集里对患者和健康人进行分类。2014年，肝硬化与肠道菌群关系的研究成果也发表在Nature上。2015年又验证了用微生物组分析来诊断代偿患者（CP）及失代偿患者（DP）的准确性，并在原来66个宏基因组物种（MGS）的基础上又发现了13个新的MGS，该成果又一次发表在Nature上。2015年，肠道微生物与结直肠腺瘤及结直肠癌的关联特征的研究成果发表于国际期刊Nature Communications。2015年10月，另一篇针对结直肠癌和肠道菌群的研究发表在国际期刊Gut上。2017年，Nature Medicine刊载了瑞金医院和华大基因合作的针对中国人肥胖和肠道菌群的研究成果。近些年的各项研究明确提出，通过肠道微生物进行一些疾病，如肝硬化、T2D、结直肠腺瘤及结直肠癌、RA、肥胖病、强直性脊柱炎（AS）等的监测是可行的。根据人体微生物组设计的各种疾病高相关性分子标记物，可以用来进行慢性疾病的早期检测，包括早期发现、早期预防和早期干预。三、肠道微生物组的疗法肠道微生物组的疗法主要是开发以人体微生物组为靶点的药物或制剂。随着科研工具的进步，科学家们对肠道微生物组的研究越来越深入，近年的研究成果为肠道微生物组治疗中靶点药物治疗提供了科学基础。比如：上海交通大学医学院附属医院宁光院士团队的研究揭示了中国人肥胖的肠道菌群组成，发现了能抑制中国汉族年轻人肥胖的肠道菌——BT菌；美国加州大学洛杉矶分校的研究人员研究发现大脑产生的信号可以影响肠道微生物的组成，反之，肠道微生物产生的化学物质可以改变人体大脑的结构；美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院的研究人员报道，肠道微生物组中的细菌促进颅内海绵状血管瘤形成，此项研究提示改变海绵状血管瘤病人的肠道微生物组可能是一种有效地治疗这种脑血管疾病的方法。目前已有多家公司从事肠道微生物组治疗研究，但他们关注的疾病类型不同，例如：Second genome公司主要关注的是传染性疾病、免疫性疾病和代谢类的一些疾病；Seres therapeutics公司关注的是传染性疾病、代谢类疾病和炎症；Vedanta biosciences公司关注的是自身免疫性疾病和炎症；Microbiome therapeutics公司关注的是糖尿病和肥胖；Assembly biosciences公司目前正在研发一种治疗艰难梭状芽孢杆菌感染的口服药剂。四、菌群移植2013年4月，美国苏拉维茨（C．M．Surawicz）教授的合作组将粪菌移植（FMT）首次写入临床指南，随后美国食品和药物管理局将粪菌移植纳入观察性新药监管，但是粪菌移植的机理尚未完全明确，第一代智能化机器也只能分离整体菌群，无法细分特定细菌。1958年始，粪菌提取需手动操作过滤；2013年，加拿大发明了一种粪菌胶囊；到了2014年，南京医科大学第二附属医院张发明教授（暨理中归元母公司普唯尔临床项目组研究者团队中主要研究者之一）研制出第一台粪菌智能化分离系统，可以在十几分钟就搞定采集粪便、分离粪菌，得到高度纯化的菌群。同益生菌相比，粪菌移植具有更复杂的细菌多样性，因此也具有更强的效果。菌群移植主要是将健康志愿者的肠道菌群转移到病人肠道中来修复患者的菌群系统，实现肠道及肠道外疾病的治疗。针对难辨梭状芽孢杆菌感染（CDI），有研究者曾对17例采用菌群移植治疗的重度复杂性CDI患者进行长期随访研究，结果显示：初次治愈率和总治愈率分别为88．2％和94．1％。鉴于FMT临床上的显著疗效，美国传染病学会（IDSA）目前已将FMT治疗方案列入复发性CDI的治疗指南中。不仅是CDI，值得一提的是，GUT发表的一篇文献中已经指出，粪菌移植在特定的在溃疡性结肠炎患者中，具有比较高的治疗成功率，文章中指出，对粪菌移植产生响应的患者在进行移植之前，粪便中的真菌细胞病毒丰度显著低于未响应的患者。这无疑为该类患者提供了一定的福音。理中归元认为，即便对该领域的研究探索才刚刚起步，但肠道微生物组学的研究热潮已经让创业者对微生物产业发展的前景兴奋不已，充满了期待。不过尽管利用宏基因组学方法研究微生物群体为人们较好地阐释了微生物群体的多样性和重要性，然而仅依靠DNA层面的分析，不能很好地研究微生物组的功能情况；我们建议利用多组学分析的方法（包括——基因组学、元转录组学、宏蛋白质组学和代谢组学），为微生物表型组提供更丰富的信息来源。可以看见的是，一系列系统研究正在逐渐揭示人体微生物神秘的面纱，越来越多的研究成果证实肠道微生物终将改变营养和医学的未来，这种充满颠覆性挑战与产业革命的预期，必将成为创业创新的动力与源泉，助推健康产业的发展。文/Amy 编辑/半夏参考资料：1、Frank D N，St AmandA L，Feldman R A，et a1．Molecuar phylogenetic characterization of microbial communityimbalances in human inflammatory bowel diseases．Proc Natl Acad Sci USA．2007，104(34)：l3780-l3785．2、Aroniadis O C，Brandt LJ，Greenberg A，et a1．Longterm follow-up study of fecal microbiota transplantation for severeand／or complicated clostridium dimcile iInfection：a multicenter experience．J Clin Gastroenterol，2016，50(5)：398-402.3.Loweukaryotic viral richness is associated with faecal microbiota transplantationsuccess in patients with UC，10.1136/gutjnl-2017-315281.

在这个广袤的世界上，存在无数各种各样的微生物，但我们对微生物了解很少，甚至不知道在我们周围有什么样的微生物。世界上所有的哺乳动物和鸟类，几乎已经全部被认知，而我们认知的微生物还不到1%。要知道，我们每个人体内都有大量微生物，一个100斤重的人，体内大约有1.5斤的微生物，它们在我们体内发挥着什么作用？如何发挥作用？是否能够成为人类健康的关键因子？是否能够超越生命体的生死，影响着生命体的未来……种种问题，指引着科学家前进的方向。微生物组是微生物学发展史上一个重要的概念性飞跃，是指一个特定环境或者生态系统中全部微生物及其遗传信息，包括其细胞群体和数量、全部遗传物质（基因组），涵盖微生物群及其全部遗传与生理功能，其内涵包括了微生物与其环境和宿主的相互作用。微生物组学是一个崭新的学科，微生物组研究取得的成果，必将为国家经济社会发展、人类生活质量改善提供源源不断的创新活力。因此，微生物组学也是一个世界各国争相发展的战略性科技领域。微生物组是整个地球生态系统的“基石”之一，从人到地球生态系统的各种生态位中，几乎无处不在，且互相紧密结合，形成完整的复杂系统；微生物组的正常状态与运行，是保证系统健康的重要因素之一，一旦出现结构失衡和功能失调，系统就会出现病态。因此，目前人类面临的从疾病流行到生态恶化、气候变化等复杂系统的病态问题，背后几乎都有微生物组失调的影响。正是认识到微生物组的重要作用，因此，美国、欧盟、日本等发达国家和地区纷纷部署支持微生物组研究的国家计划。发达国家纷纷启动了微生物组计划。例如，美国在2016年5月宣布启动“国家微生物组计划”，将支持跨学科研究，解决不同生态系统中微生物的基本问题；开发平台技术，对不同生态系统中微生物组的认识以及知识的积累，并提高微生物数据的访问等。欧盟也启动了me taHIT计划，致力于建立人肠道微生物基因与人体健康和疾病的关系。不少科学家认为，鉴于微生物组研究的庞大体量和广泛内容，任何一个国家都不可能独立完成，未来很可能会形成一个类似人类基因组计划的国际大科学计划。在深入实施创新驱动发展战略的进程中，中国科学家要积极提出并牵头组织国际大科学计划和大科学工程。能否实现这一目标，从某种程度上取决于我们的相关研究处于什么水平和地位，因此，尽快启动中国微生物组研究计划就成为题中之义。日前，“中国科学院微生物组计划”启动，它将作为种子项目，引领“中国微生物组计划”生根发芽。而这，也是我们积极参与，并主导国际大科学计划的基础。相关链接“中科院微生物组计划”的5个课题人体肠道微生物组：初步阐明肠道微生物与宿主营养代谢的关系和机制，及其在常见营养相关性疾病发生、发展、诊断、治疗中的作用及可能的机制，同时开发相关的疾病诊断模型、微生物菌剂来预防、治疗相关疾病。家养动物肠道微生物组：从肠道微生物组新视角出发，发掘功能肠菌或相关代谢产物，提升动物免疫水平，建立微生物组干预新策略，解决我国畜牧业发展中面临的疫病频发等问题，在未来动物养殖抗生素替代方面能够产生显著的经济效益，同时在环境保护方面也具有积极的作用。活性污泥微生物组：解析活性污泥微生物组的结构与组成，揭示功能单元的形成机制，研发新型分子标记指征活性污泥微生物组功能，建立抗生素抗性基因序列数据库、活性污泥参考数据库和功能菌群互作关系分析平台，建立功能调控示范系统，为指导活性污泥微生物组功能原位调节，控制污泥膨胀，提升废水处理效能提供新思路。微生物组功能解析技术与计算方法学：技术方面，掌握微生物组拉曼成像技术、微生物组高通量培养技术、微生物组大数据挖掘技术；装备方面，实现菌群单细胞拉曼分选与测序耦合功能的样机、液滴阵列单细胞培养仪样机、固体纳米孔微生物多样性芯片；软件方面，发展拉曼组分析三部曲软件包、元基因组遗传变异分析软件包、单细胞基因组拼装与分析软件包。中国微生物组数据库与资源库：建立中华肠道微生物组样本长期稳定及高保真保藏技术；建立中华肠道微生物组菌种的高通量分离、快速鉴定及保藏技术；制订中华微生组样本库和菌种库技术规范；建立中华微生物组样本库、中华健康人群肠道微生物组菌种库、代谢综合征特征微生物菌种库等中华微生物组菌种库，收集、整合菌种资源超过10000株，物种数量超过500种。构建中华人肠道微生物组、亚健康微生物组等数据管理平台及数据库，建立高质量的中华微生物组参考数据库，建立微生物群落研究的功能组学新技术及整合分析平台，实现大规模数据及分析结果的可视化。