生物多样性的研究方法

本文参加#科学了不起#系列征文赛。生物体通过代谢废物、脱落的皮肤细胞等行为向周围环境排出DNA，这种遗传物质被称为环境DNA（eDNA）。由于eDNA可以直接从水、土壤或空气中收集，并使用分子工具进行分析，而不需要捕获生物本身，因此，这种遗传信息可以用来报告生物多样性的情况。例如，通过对水中的eDNA进行取样和测序，可以确定多个鱼类物种的存在，同时避免采用各种有害的捕捞方式。虽然eDNA方法已经应用于一些关于不同类型水生生境（河流、湖泊和海洋系统）中鱼类多样性的研究，但其在量化物种丰度（每个物种的个体数量）方面的效率还有待确定。尽管以前的研究是在受控的水生系统中进行的，如水族馆、实验槽和人工池塘，报告了水中发现的DNA数量与物种丰度之间的正相关关系，但在自然环境中的结果如何仍不清楚。来自赫尔大学的一个研究小组与英国环境局一起，将在英国渔场进行的入侵物种铲除计划作为案例研究，评估eDNA采样在识别自然水生环境物种丰度方面的成功率。他们的研究结果发表在《Metabarcoding and Metagenomics》上。"自然水生环境中eDNA的定量分析是很困难的，因为没有办法确定水生系统中真实的物种丰度和生物量（重量），除非从水中捕获所有目标生物并对它们进行计数/测量，"赫尔大学博士生Cristina Di Muri解释说。在清除过程中，原有的鱼塘被排干，除了入侵物种口吻龙虾外，所有的鱼都被放置在新的池塘中，而原有的池塘则用杀虫剂进行处理，以清除入侵物种。清除后，这些鱼又被放回原来的池塘。同时，专家对所有个体进行了计数、鉴定和称重，可以精确估算鱼类的数量和生物量。然后，研究人员进行了水采样，并进行了遗传分析，以评估鱼类遗传序列的多样性和丰度，并将结果与人工收集的数据进行比较。发现鱼类eDNA的数量与实际鱼类物种的生物量和丰度之间存在很强的正相关关系，证明了水中鱼类DNA序列的数量与自然水生环境中鱼类的实际丰度之间存在很强的关联性。科学家们成功地识别了池塘中的所有鱼种：从最丰富的鱼种（即293条总重852千克的鲤鱼）到最不丰富的鱼种（即一条0.7千克的鲢鱼），这表明非侵入性方法的准确性很高。"此外，我们采用了不同的eDNA捕获和存储方法，发现不同eDNA方法的遗传分析结果具有可比性。这种一致性使得eDNA协议具有一定的灵活性，这是保持不同研究结果可比性的根本，同时，根据调查的地点或可用资源，还可以选择最合适的策略。"Di Muri阐述道。"利用eDNA分析准确评估自然环境中物种多样性和丰度的机会，将推动未来物种监测计划的进一步改变，因为这种非侵入性、灵活的工具可以适应所有的水生环境，它可以在不妨碍生物的情况下进行定量的生物多样性监测。"论文标题为《Read counts from environmental DNA (eDNA) metabarcoding reflect fish abundance and biomass in drained ponds》。

5月22日是“国际生物多样性日”。生态环境部副部长庄国泰不久前表示，目前，我国各类自然保护地面积约占陆地面积的18%以上，绝大多数国家重点保护野生动植物物种得到保护，朱鹮、东北虎等近10种濒危物种种群开始恢复，60多种珍稀濒危野生动物人工繁殖成功。第十五次《生物多样性公约》缔约方大会（COP15）拟今年在昆明举办，联合国《生物多样性公约》秘书处代理执行秘书伊丽莎白·穆雷玛认为，中国所倡导的建设生态文明不仅仅是中国的美好愿景，同时也反映了全世界和全人类的共同愿望。生物多样性是人类社会赖以生存和发展的重要物质基础，与每个人的生产、生活息息相关。同时，世界各国也都有责任保护其本国的生物多样性，并应展开合作，以可持久的方式使用生物资源。但令人关切的是，一些人类活动正在导致组成生物多样性的物种迅速减少。那么利用现代生物科学技术，我国在保护生物多样性方面做了什么？基因组测序： 寻找中国纯种绿孔雀今年以来，中科院昆明动物研究所鸟类学学科组带头人杨晓君研究员开心了好久：他饲养繁育的几个“宝贝”陆陆续续下了20多个蛋。这些蛋来得相当不易，这可是纯种绿孔雀的蛋。为了“纯种”二字，杨晓君和他的团队努力了六七年之久。“近年来，绿孔雀的种群数量在下降。上世纪90年代的调查和最近几年的调查结果表明，下降趋势是非常严重的。同时，我们也做了人工领养绿孔雀的调查，结果发现，领养的绿孔雀也没有纯种的了。” 杨晓君说，种群数量的急剧下降，让绿孔雀在中国境内面临灭绝的危险，从而对我们的生物多样性产生冲击；而没有纯种的领养绿孔雀，也会对后续种群恢复造成威胁。绿孔雀的危机不是个例。穆雷玛接受科技日报记者采访时表示：“我们现在所面临的问题和挑战不是单一的，而是全方位的。最近的科学研究表明，我们正面临着前所未有的生物多样性挑战。”她手中的报告显示，现在地球上物种消亡的速度正在加快，有千余种濒危物种正面临灭绝的危险。用新的基因组测序技术，比对纯种与有其他物种产生基因交流的孔雀，比对国外同行公开的基因组数据，杨晓君团队转战云南横断山和大小保护区，终于找到了六七只“宝贝”，并带到精心模仿野外生境的中科院昆明动物研究所实验室。“我们的保护和研究出现了一缕曙光，但离足够多的种群间基因交流的目标还有不小距离。”杨晓君说。事实上，生物技术是对现有的珍稀植物和动物进行改良。如今，不仅在动物学界、植物学界，甚至在原核生物界与真菌学界，无数中外科学家正在努力，试图用生物技术拯救濒危、极危物种。“五库一体”： 保护野生种质资源的“诺亚方舟”1992年11月7日，全国人大常委会批准我国加入《生物多样性公约》缔约国。在这个公约中，生物技术被定义为“使用生物系统、生物体或其衍生物等技术，来制作或改变产品以达到特定用途的目的。”在国家大科学装置、世界第二大种质资源库——中国西南野生生物种子资源库的植物种质保藏中心和分子实验平台上，每天有近百位科学家在做着琐碎、细微而又极其重要的工作。他们把从我国各地采集到的形形色色有花植物种子加以分类、清理和必要的加工，然后冷藏到零下20摄氏度的植物种子库里或零下196摄氏度的液氮中。“这个资源库的保存模式为‘五库一体’，即以植物种子库为核心库，兼具植物离体库、植物DNA库、动物种质库和微生物库。”中科院昆明植物研究所植物多样性与基因组学团队带头人李德铢研究员向科技日报记者介绍，70%的种子资源进入到植物种子库，通过干燥和冷冻技术处理后长期存储，同时为资源利用和科学研究提供材料；而植物离体库的任务，主要保存中间性和顽拗性种子，以及难以用种子保存的植物，保存的材料包括试管苗、愈伤组织、块根、块茎、鳞茎、球茎、花粉、孢子以及微繁殖体或培养物；在DNA库中，则筛选和鉴定了一批具有重要价值的功能基因；动物种质库主要保存珍稀濒危的特有野生脊椎动物种质资源，兼顾收集野生近缘种和特种经济动物的种质资源；微生物库则长期、安全、有效地保存具有重要经济价值的大型真菌种质资源，同时强调对放线菌和特殊生境微生物种质资源的收集。“截至2019年底，我们已经在这座种子的‘诺亚方舟’里珍藏了10096种种质资源，植物类种质资源占我国植物总数的34.5%。一个小小的罐子里甚至可以装2万粒种子，他们可以有效保持几百年甚至上千年。”李德铢说。在动物种质资源方面，这个大科学装置在短时间保存生殖细胞及胚胎细胞中取得了一些成功的案例，但目前从全世界范围来讲，动物种质资源的保存还存在很大的难度。“我们保存了6000多种动物DNA材料。目前的技术条件下，这些材料绝大部分还不能恢复成一个正常的生物个体，但可为未来的保护提供一种重要储备。”李德铢表示。人工扩繁： 既保护物种数量又发挥经济价值白魔芋和云南梧桐，是我国金沙江流域的两种特有物种，但由于种群数量小、生境狭窄、受人类干扰严重，随时面临灭绝危险。中科院昆明植物研究所极小种群野生植物综合保护团队带头人孙卫邦认为，白魔芋具有药食两用的价值，经过人工授粉，可大幅提高结实率，远期看商业种植具有可观经济效益；而云南梧桐全身都是宝，尤其桐子具有极高的营养价值，植株本身可做优质园林和景观绿化树种，经人工扩繁和有序利用，有望逃离濒危的“苦海”。“有的物种，我们不能把它圈起来或栽活几个样板就了事，不但要保护其种群数量稳定恢复增长，还要发掘其经济价值和美学价值，让其产生多重效益，也才能实现可持续发展。”孙卫邦表示，他们近年来在漾濞槭、华盖木等特有植物、濒危和有重要经济利用价值植物的保护上取得了令人瞩目的成果。近年来，他们还将极小种群保护的理念和方法，推广到珍稀濒危野生动物的保护上。这与《生物多样性公约》中保护地球生物多样性、可持续利用生物多样性和公平公正分享遗传资源的三大目标相一致。“总的来说，由于我们的物种非常多，濒危的物种也非常多，其中很多物种，我们没办法进行迁地保护，只能以划定综合保护区的方式进行。”云南农业大学教授董扬说，而有些物种，特别是一些根系发达的植物，比如说兰科植物，还有一些极度濒危的植物和哺乳动物，可以迁地保护。我们要根据不同的生物物种、不同的情况辩证施策，不可能采取同一种模式。来源：科技日报

近日，由世界自然基金会（瑞士）北京代表处、深圳市一个地球自然基金会与清华同衡规划设计研究院联合撰写的《城市生物多样性框架研究》报告正式对外发布。“我们试图提出具有一定普适性的城市生物多样性保护策略和行动计划，以期为城市生物多样性工作给予启示参考。”清华同衡规划设计研究院院长袁昕表示，“为那些重视城市生物多样性的城市提供框架性的指引，促成先锋城市率先行动起来。”据了解，中国是世界上生物多样性最丰富的国家之一，也是生物多样性受威胁程度最严重的国家之一。中国作为《生物多样性公约》最早的缔约国之一，在履约方面做了大量卓有成效的工作，成立了由国务院副总理任主席的中国生物多样性保护国家委员会，出台了一系列法规、政策、规划。这份报告提出了城市生物多样性六大策略与25项行动计划，其中包括加强调查、记录和科学研究，建立共享信息平台；将城市生物多样性理念纳入国土空间规划；修复城市受损空间，改善城市生态环境；将生物多样性纳入城市政策和决策； 探索绿色金融，增加城市生物多样性投资；提高城市生物多样性保护的市民意识与社会参与度等方面。同时，报告还提出提出了包括生态系统服务、基于自然的解决方案、气候变化、城市微气候等十个与城市生物多样性相关的概念，并介绍了城市生物多样性在生物多样性、生态系统服务价值、认知、保护与管理四个层面的调查内容与常用方法，总结了针对于城市的生物多样性调查框架体系，旨在唤醒人们对身边生物多样性的认识，给城市提供框架性指引，促成有条件的城市行动起来。来源 北京日报客户端 | 记者 孙毅编辑 蔡文清流程编辑 刘伟利

在中国，人类数量的增长和自然环境的矛盾一直存在，我们已经习惯了身边没有动物的陪伴，只有在人迹罕至的深山老林，才能看到警惕的野生动物少量存在。滇金丝猴所以在我们国家，自然生态和野生动物的爱好者、研究者、摄影师的数量是非常少的，而以自然生态和野生动物摄影作为业的职业摄影师就更少见了。那么，彭建生老师、董磊老师、左凌仁老师所从事的影像生物多样性调查是什么？他们又是怎样工作的呢？一起来了解一下吧！夏季研学营课堂上彭建生老师的分享从夏季的三江并流生态研学营，到冬季的滇西北影像生物多样性调查研学营，一个词频繁地出现在研学营导师们的介绍里、课程分享里，那就是“影像生物多样性调查”。夏季研学营课堂上彭建生老师的分享影像生物多样性调查是一种生物多样性调查方法，主要用拍摄带有科学数据的野生动植物数码照片和视频来进行生物多样性调查、评估、监测和宣传展示。董磊老师工作照上世纪八、九十年代，《美国国家地理》杂志在全球销量高达1300万份，催生一批顶尖自然摄影师的诞生。他们进入非洲、南美，潜心拍摄，影像作品在全球广为传播，一批野生动物形象由此深入人心。红胸角雉而中国，始终是一片处女地。从荒凉野性的可可西里，到千米雪山连绵不断的三江并流区，不仅有丰富的种群，更有很多罕有人知、独属于中国的动植物。藿香叶绿绒蒿在影像生物多样性调查摄影师的眼里，摄影具有审美和科学取证的双重属性。国外有博物学传统，达尔文随军舰远行，会带上几位画师，随时画下物种样貌。今天的野生摄影师，相当于当年的画师。于是，在寒冷四月凌晨五点的悬崖边，在百公里内都没有人烟的无人区，在翻越N个山头徒步穿越丛林才能抵达的沟谷里，您总能看到他们的身影……在藏地拍摄的摄影师们在这样高难度、艰苦、恶劣的环境下，影像生物多样性调查摄影师团队完成了一个几乎“不可能完成的任务”——他们在中国为人迹罕至的角落拍摄了大量精彩的照片，其中包含异常珍稀、难得一见的物种。在西藏那曲的棕熊他们趴冰卧雪几天的守候，只为等待动物和自然环境结合得为紧密的一张照片；他们用各种摄影手法，红外、紫外、微距、显微、水下、航拍，只为以影像的语言揭开自然的面纱；他们开创了照片、活动影像、科学数据、文字资料等相结合的自然生态调查方法，已经被众多自然保护区和国家公园所认可。在青海发现的雪豹这是一群有理想、有信念、有毅力的自然生态和野生动物摄影师，为中国的自然普及和保育做出了巨大贡献；他们自己也乐在其中，愿意分享自己的快乐和热情。藏羚羊作为其中的一员，彭建生老师夏季研学营分享时说到：“我们的工作和其他的摄影师有很大的不同，影像生物多样性调查的本质是调查，摄影是调查的方法与手段，有它自己的系统要求与标准。需要对调查区域内的生物多样性做全面的调查，也就是您见到什么都需要拍摄下来。何为生态摄影/彭建生老师课堂分享我们是摄影师，要比科学家记录的更美。科学的素质和摄影师的审美是影像生物多样性调查的特质，两个方面都不可或缺。自然摄影经常会有让人怦然心动的时刻。在野外，对面突然出现一头大型哺乳动物，肾上腺素顿时激发您全身紧张、兴奋、按耐不住的心跳。这种刺激是其他题材拍摄、艺术，乃至生活中几乎完全感受不到的，我太喜欢这种野性的遭遇！而大自然总是能不断给您这种特殊的体验，所以我在野外总是期盼这种刺激，不断领受这种激情，在大家眼里也就一直保持旺盛的精力。纳帕海我的拍摄目的不在于拿奖，而在于通过影像的广泛传播，让人们了解雪豹，喜欢雪豹，关注雪豹，从而关注整个青藏高原的生态环境改善。珍妮古道尔说过：唯有了解才会关心，唯有关心才会行动，唯有行动，生命才有希望！”纳帕海黑颈鹤避开人头涌动的春节大假，行走在滇西北郁郁葱葱的山谷里，在自然博物学家的带领下，前往5个隐秘的世界，考察到此越冬的候鸟，与世代栖息在此地的野生动物。洱源西湖一起学习博物知识，发现美丽中国，感受自然应有的样子。

参考消息网12月28日报道英国《卫报》网站12月25日刊发题为《“神秘物种”的发现表明地球生物多样性超出过去认知》一文，作者为帕特里克·格林菲尔德。全文摘编如下：过去一年里，越来越多隐藏在众目睽睽之下的“神秘物种”露出了本来面目，这在一定程度上受到了脱氧核糖核酸（DNA）条形码技术兴起的推动，这种技术可利用基因差异对动植物物种进行识别和区分。科学家说，我们这个星球生物的多样性可能要超过过去的认知，有关物种总数的估计数字可能远高于目前的最佳预测（870万种）。但隐秘物种的发现通常意味着，曾被认为很常见、很普遍的某个特定物种实际上包含多个物种，而其中有的物种可能濒临灭绝，需要立即加以保护。在一定程度上来说，这些神秘物种的发现是由DNA条形码技术推动的，这种技术能够利用基因差异对动植物物种加以区分辨别。从非洲大象、印度藤蛇到南美洲新热带区的鸟类等，越来越多的生物露出了本来面目。预计未来几年还会在活体生物和博物馆样本中发现数千个新物种。“DNA条形码技术是一种让我们能比过去更精细地发现物种差异的工具，就像显微镜能让我们看到肉眼看不到的表面结构的细节一样，”洛杉矶自然历史博物馆昆虫馆馆长布赖恩·布朗说，“这项技术为我们提供了一种方法，由此可在我们划定的物种范围内，对在生物多样性方面我们此前有所怀疑但未加探究的物种进行界定。这项技术正在揭示出，这个世界的生物多样性甚至超出了我们此前的预想。”哥斯达黎加西北部的瓜纳卡斯特保护区最先利用DNA条形码技术开展了神秘物种发现工作。该地区目前也是地球上使用DNA条形码技术最多的地方。有“DNA条形码技术之父”称号的加拿大人保罗·赫伯特教授与毕生研究瓜纳卡斯特保护区的宾夕法尼亚大学教授丹尼尔·詹曾和温妮·霍尔瓦克斯一道，于2004年在一篇名为《物种十合一》的论文中揭示了双列闪蝶的真实身份。双列闪蝶是一种困扰詹曾长达数十年之久的昆虫。生物分类学领域的共识告诉这位81岁高龄的进化生态学家，他在瓜纳卡斯特保护区收集到的这种毛毛虫标本是一种普通寻常的热带蝴蝶，从美国得克萨斯州到阿根廷北部地区都能找到。但詹曾对这种观点不以为然。詹曾一直对双列闪蝶幼虫的多样性以及它们所食用植物种类的多样性感到困惑。2004年他有机会测试赫伯特提出的DNA条形码的争议性新技术，测试结果令人兴奋不已。DNA条形码技术分析结果表明，这种双列闪蝶实际上至少有10种具有独特基因特性的物种。这种蝴蝶作为一个神秘物种被曝光，由此可能意味着，在拉美其他地区有成千上万个不明昆虫物种等待进行特性界定，此外还有许多不明昆虫物种从未被采集和研究过。

森林是全球生态系统的核心，在为社会发展提供支撑的同时，与人类同样有着非常密切的关联，保护森林生态，发展林业不再是单纯的经济问题，还关系着生态平衡以及人类的发展。林业有害生物产生的根源是森林生态系统中的生物多样性遭到了破坏，因此在对其进行防治的过程中，同样应该从生物多样性保护着手，做好综合管理。1.生物多样性保护与林业有害生物防治的意义作为陆地生态系统的主体，森林中所具备的生物类型在陆地生物总量中所占的比重超过80%，是非常重要的物种基因仓库。森林生物多样性保护对于森林生态系统的建设和完善意义重大：①生物多样性有利于加深生物之间的联系，使得其能够在相互影响下，得到协同进化；②生物多样性保护可以实现对于物种遗传基因的保存，这也是保障物种多样性的核心所在，若森林生态系统失衡或者遭到严重破坏，则可能带来一些珍稀物种的灭绝。同时，在自然生态系统中，任何物种的消失都是不可逆的，其对于整个人类社会的发展有着极其严重的影响。在这种情况下，生物多样性保护非常重要。树木的生长周期相对较长，在生长过程中经常会遭受林业有害生物的侵袭，尤其是大规模种植的人工林，因为林木结构单一，对于林业有害生物的抵御能力较差，一旦遭遇侵袭，会导致林木生长速度减缓乃至枯死，引发巨大经济损失的同时，也会影响生态环境建设工作的顺利进行。2.生物多样性与林业有害生物现状2.1生物多样性现状相关统计数据显示，我国现有森林面积接近2亿h㎡，森林覆盖率达到22.96%，森林中生存的物种类型占据所有陆生野生物种的80%以上，高等植物数量超过30000种，居世界第三；陆栖脊椎动物的种类占据世界总数的10%左右。而最近几年，受利益驱动，不少地区都出现了过度开采森林资源的情况，导致森林生物的多样性急剧减少。有研究表明，当前我国有接近5000种高等植物因为自然因素或者人为因素的影响，处于濒临灭绝的状态，而很多原产于我国的珍稀物种，如高鼻羚羊、野马等，如今已经完全绝迹。生物多样性会受到土壤、气候条件、人为干扰等因素的影响，在所有的影响因素中，森林采伐是主要原因，其会对采伐区的土壤、光照、水分等产生直接影响，在失去植被覆盖的情况下，阳光直接照射地面，导致地表水分快速蒸发，湿度下降温度升高，引发土壤微环境以及性质的改变，这种看似不明显的变化却可能给部分受环境影响较大的物种带来毁灭性的威胁，导致森林中物种群落的减少，引发生态环境的破坏，森林中植物会随之消失，动物的生存环境同样会受到很大影响，在无法生存的情况下，动物会迁移到别的地方。另外，森林作业环节，会用到各种现代化设备，其虽然能够显著提高作业效率，减轻作业人员的劳动负担，但是也容易给地表植被造成破坏，也可能通过破坏土壤环境的方式来间接影响植被的生长，这同样可能会引发森林生物多样性衰减。2.2林业有害生物现状总体来讲，我国林业有害生物呈现发生面积大、波及范围广、蔓延迅速、成灾类型多等特征，对照相应的历史数据可看出，20世纪50年代，全国每年林业有害生物爆发的面积为100万h㎡，60年代为140万h㎡，70年代初为360万h㎡，70年代末达到533万h㎡，80年代后，每年林业有害生物的发生面积超过667万h㎡，且有快速增长的趋势。同时，大量温室气体排放所引发的气候异常为林业有害生物的爆发提供了有利的环境条件，也使得其治理难度大大增加。就目前而言，能够形成严重灾害的林业有害生物数量不断增长，而且有很多都是从外地迁移进来，如松毛虫、青杨天牛、天幕毛虫等，这些林业有害生物多数具有爆发成灾的特点，引发直接经济损失的同时，也会给当地的生态效益和社会效益产生难以估量的影响。　3.生物多样性保护与林业有害生物的综合管理3.1建立物种基因库依照森林所具备的不同功能和作用，林业部门应该选择不同的经营手段，为生物多样性保护提供新的思路，而借助分类经营管理的方式，可以推动林业的可持续发展。例如，对于一些破坏程度较小的天然林，可以借助绿色保留地作业法的方式，为野生动物提供栖息地，为植物种子的生长提供苗床，平衡土壤水分的同时增加土壤肥力；对于结构相对单一的人工种植林，不能一味考虑经济效益，还应该通过适度采伐的方式来降低森林的密度，通过不同树种的交叉种植来丰富林分结构，对择伐等科学的采伐方式进行推广，在经济层面实现可持续发展的同时，实现对于生物多样性的保护。通过构建物种基因库，能够实现森林生物多样性保护，从工作人员的角度，在实际操作中，应该借助基因数据库建设，推动区域内基因保护网络的构建和完善，以生境走廊为支撑，连接其相互独立的区域，推动全球生物多样性保护的合作，以先进技术来实现森林生态环境的保护和发展。3.2强化有害生物防治（1）化学防治。它是消灭林业有害生物最为直接有效的手段，能够在短时间内完成对于大面积林业有害生物的压制。为了尽量减少化学药物对于生物多样性的破坏，在对药物进行使用的过程中，应该对药物成分和使用方法进行深入研究，在保证防治效果的同时，保护其他生物免受伤害。（2）生物防治。一方面，可以进行封山育林，减少人为破坏，对原始森林稳定的生态系统进行保护，也可以保护生物多样性；另一方面，可以引入天敌，做到以虫治虫，对于一些本土没有的天敌种类，可以通过人工繁殖的方式扩大种群，然后放入森林中。在这个过程中，需要考虑天敌生物对于其他植物和动物的影响，对其繁衍能力进行评估，做好种群数量控制。　4.结语总而言之，生物多样性变化会直接影响林业有害生物，保护生物多样性同时也是保护森林免受林业有害生物侵扰，两者之间并不存在矛盾冲突。事实上，林业可持续发展背景下，想要实现对于林业有害生物的综合管理，同样需要引入生物多样性保护的理念，借助科学的技术手段和防治措施，提升林业有害生物的防治效果。撰稿：王文生 陈宏宇 内蒙古额尔古纳国家级自然保护区管理局森防站本文刊发于《中国高新科技》杂志2020年第19期（转载请注明来源）

来源：科技日报科技日报昆明7月3日电 (记者赵汉斌)记者3日从中科院昆明动物研究所获悉，该所马占山研究员在国际期刊《生物地理学杂志》上发文，基于一个用于描述生物多样性时空分布的新数学模型，提出一项预测估计潜在生物多样性的方法。潜在生物多样性也被称为“暗”生物多样性，其概念类似于物理学中“暗物质”，一般指局部群落中可能并不存在，但存在于特定生境的区域物种库中的物种，如用于预测未来气候变化条件下全球生物多样性潜在变化，或估计各个地质年代曾经历过的生物多样性变迁。而在微生物菌群研究中，其意义更为特殊，例如研究人体内或人群中菌群多样性动态变化的潜在峰值等。马占山介绍，潜在生物多样性重要特征之一，是“暗”多样性的研究或估计，受观察者或观察时空影响，因此有学者提出用量子力学模型进行估计。在家居环境中，由于不同方位的室内环境可能具有不同光照和温湿度条件，自然会影响室内环境中的菌群种类和数量，即菌群多样性。室内菌群的研究是目前建筑学和微生物交叉研究领域的重要热点课题，已有科学家探索室内环境微生物菌群动态对于居民健康的影响。此项研究，正是以室内居家环境菌群动态变化的数据，示范了“潜在多样性”的预测估计。作者提出了新的模型，采用室内包括了来自人、宠物、家居环境的菌群多样性数据，有效描述了不同时空菌群多样性的三维动态变化，并指出，住宅中一些影响居民生活和健康且难以解释的因素，或许就是小小微生物菌群在作怪。

微生物群落测序是指对微生物群体进行高通量测序，通过分析测序序列的构成分析特定环境中微生物群体的构成情况或基因的组成以及功能。借助不同环境下微生物群落的构成差异分析我们可以分析微生物与环境因素或宿主之间的关系，寻找标志性菌群或特定功能的基因。对微生物群落进行测序包括两类，一类是通过16s rDNA，18s rDNA，ITS区域进行扩增测序分析微生物的群体构成和多样性；还有一类是宏基因组测序，是不经过分离培养微生物，而对所有微生物DNA进行测序，从而分析微生物群落构成，基因构成，挖掘有应用价值的基因资源。以16s rDNA扩增进行测序分析主要用于微生物群落多样性和构成的分析，目前的生物信息学分析也可以基于16s rDNA的测序对微生物群落的基因构成和代谢途径进行预测分析，大大拓展了我们对于环境微生物的微生态认知。目前我们根据16s的测序数据可以将微生物群落分类到种（species）（一般只能对部分菌进行种的鉴定），甚至对亚种级别进行分析，几个概念：16S rDNA（或16S rRNA）：16S rRNA 基因是编码原核生物核糖体小亚基的基因，长度约为1542bp，其分子大小适中，突变率小，是细菌系统分类学研究中最常用和最有用的标志。16S rRNA基因序列包括9个可变区和10个保守区，保守区序列反映了物种间的亲缘关系，而可变区序列则能体现物种间的差异。16S rRNA基因测序以细菌16S rRNA基因测序为主,核心是研究样品中的物种分类、物种丰度以及系统进化。OTU：operational taxonomic units (OTUs)在微生物的免培养分析中经常用到，通过提取样品的总基因组DNA，利用16S rRNA或ITS的通用引物进行PCR扩增，通过测序以后就可以分析样品中的微生物多样性，那怎么区分这些不同的序列呢，这个时候就需要引入operational taxonomic units，一般情况下，如果序列之间，比如不同的 16S rRNA序列的相似性高于97%就可以把它定义为一个OTU，每个OTU对应于一个不同的16S rRNA序列，也就是每个OTU对应于一个不同的细菌（微生物）种。通过OTU分析，就可以知道样品中的微生物多样性和不同微生物的丰度。测序区段：由于16s rDNA较长（1.5kb），我们只能对其中经常变化的区域也就是可变区进行测序。16s rDNA包含有9个可变区，分别是v1-v9。一般我们对v3-v4双可变区域进行扩增和测序，也有对v1-v3区进行扩增测序。16s rDNA分析基本流程：原始数据处理：原始测序数据需要去除接头序列，并将双端测序序列进行拼接成单条序列。根据测序barcode序列区分不同的样本序列。过滤低质量序列和无法比对到16s rDNA数据库的序列。OTU分类和统计：OTU(operational taxonomic units) 是在系统发生学研究或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元（品系，种，属，分组等）设置的同一标志。通常按照 97% 的相似性阈值将序列划分为不同的 OTU，每一个 OTU 通常被视为一个微生物物种。相似性小于97%就可以认为属于不同的种，相似性小于93%-95%，可以认为属于不同的属。样品中的微生物多样性和不同微生物的丰度都是基于对OTU的分析。使用QIIME（version 1.8.0）工具包进行统计注释。使用QIIME（version 1.9.0, http://bio.cug.e.cn/qiime/）的ucluster方法根据97%的序列相似度将所有序列进行同源比对并聚类成operational taxonomic units (OTUs)。然后与数据库GreenGenes（version gg_13_8, http://greengenes.lbl.gov/cgi-bin/JD_Tutorial/nph-16S.cgi）进行比对，比对方法uclust，identity 0.9 。然后对每个OTUs进行reads数目统计。下面的2个表，其中一个表是对每个样本的测序数量和OTU数目进行统计，并且在表栺中列出了测序覆盖的完整度（显示前10个样本）。另一个表是对每个样本在分类字水平上的数量进行统计，并且在表栺中列出了在每个分类字水平上的物种数目（显示前10个样本）。可以看到绝大部分的OTU都分类到了属（Genus），也有很多分类到了种（Species）。但是仍然有很多无法完全分类到种一级，这是由于环境微生物本身存在非常丰富的多样性，还有大量的菌仍然没有被测序和发现。测序数目统计表主要是对每个样本的测序数量和OTU数目进行统计，并且在表格中列出了测序覆盖的完整度（显示前10个样本，如果样本超过10个，请查看结果中otu_stat.txt文件）其中 SampleName表示样本名称；SampleSize表示样本序列总数；OTUsNumber表示注释上的OTU数目；OTUsSeq表示注释上OTU的样本序列总数。Coverage是指各样品文库的覆盖率，其数值越高，则样本中序列没有被测出的概率越低。该指数实际反映了本次测序结果是否代表样本的真实情况。计算公式为：C=1-n1/N  其中n1 = 只含有一条序列的OTU的数目； N = 抽样中出现的总的序列数目。分类水平统计表主要是对每个样本在分类学水平上的数量进行统计，并且在表格中列出了在每个分类学水平上的物种数目（只显示前10个样本，如果样本超过10个，请查看结果中taxon_all.txt文件）其中SampleName表示样本名称；Phylum表示分类到门的OTU数量；Class表示分类到纲的OTU数量；Order表示分类到目的OTU数量；Family表示分类到科的OTU数量；Genus表示分类到属的OTU数量；Species表示分类到种的OTU数量。我们还可以对这些种属的构成进行柱状图显示：横坐标中每一个条形图代表一个样本，纵坐标代表该分类层级的序列数目或比例。同一种颜色代表相同的分类级别。图中的每根柱子中的颜色表示该样本在不同级别（门、纲、目等）的序列数目，序列数目只计算级别最低的分类，例如在属中计算过了，则在科中则不重复计算。Q: 为什么要选择V3-V4区的测序长度？为什么有些文献是V6区，有什么区别？A:  16S rRNA总长约1540 bp，包含 9个可变区。由于高通量测序的测序长度的限制，不可能将16S rRNA的9个可变区全部测序，所以在PCR扩增时往往只能选择1-3个可变区作为扩增片段。Kozich 等评估了Miseq测序仪分析的不同16S rRNA可变区的准确性发现，测定 V4 区效果最佳。根据我们的测序长度，v3-v4区是最佳选择。我们还需要对样本之间或分组之间的OTU进行比较获得韦恩图：注意，韦恩图目前一般最多只能显示5个样本或分组，过多的样本无法无法进行韦恩图绘制样品构成丰度：稀释曲线微生物多样性分析中需要验证测序数据量是否足以反映样品中的物种多样性，稀释曲线（丰富度曲线）可以用来检验这一指标。稀释曲线是用来评价测序量是否足以覆盖所有类群，并间接反映样品中物种的丰富程度。稀释曲线是利用已测得16S rDNA序列中已知的各种OTU的相对比例，来计算抽取n个（n小于测得reads序列总数）reads时出现OTU数量的期望值，然后根据一组n值（一般为一组小于总序列数的等差数列）与其相对应的OTU数量的期望值做出曲线来。当曲线趋于平缓或者达到平台期时也就可以认为测序深度已经基本覆盖到样品中所有的物种；反之，则表示样品中物种多样性较高，还存在较多未被测序检测到的物种。下图中的稀释曲线横坐标代表随机抽取的序列数量；纵坐标代表观测到的OTU数量。样本曲线的延伸终点的横坐标位置为该样本的测序数量，如果曲线趋于平坦表明测序已趋于饱和，增加测序数据无法再找到更多的OTU；反之表明不饱和，增加数据量可以发现更多OTU。Shannon-Winner曲线Shannon-Wiener 曲线，是利用shannon指数来进行绘制的，反映样品中微生物多样性的指数，利用各样品的测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建曲线，以此反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性。 当曲线趋向平坦时，说明测序数据量足够大，可以反映样品中绝大多数的微生物物种信息。与上图一样，横坐标代表随机抽取的序列数量；纵坐标代表的是反映物种多样性的Shannon指数。样本曲线的延伸终点的横坐标位置为该样本的测序数量，如果曲线趋于平坦表明测序已趋于饱和，增加测序数据无法再找到更多的OTU；反之表明不饱和，增加数据量可以发现更多OTU。其中曲线的最高点也就是该样本的Shannon指数，指数越高表明样品的物种多样性越高。Q: Shannon指数怎么算的？A: Shannon指数公式：其中，Sobs= 实际测量出的OTU数目；ni= 含有i 条序列的OTU数目；N = 所有的序列数。Rank-Abundance曲线用于同时解释样品多样性的两个方面，即样品所含物种的丰富程度和均匀程度。物种的丰富程度由曲线在横轴上的长度来反映，曲线越宽，表示物种的组成越丰富；物种组成的均匀程度由曲线的形状来反映，曲线越平坦，表示物种组成的均匀程度越高。一般超过20个样本图就会变得非常复杂而且不美观，所以一般20个样本以下会做该图，图片保存为结果目录中rank.pdf。横坐标代表物种排序的数量；纵坐标代表观测到的相对丰度。样本曲线的延伸终点的横坐标位置为该样本的物种数量，如果曲线越平滑下降表明样本的物种多样性越高，而曲线快速陡然下降表明样本中的优势菌群所占比例很高，多样性较低。Alpha多样性（样本内多样性）Alpha多样性是指一个特定区域或者生态系统内的多样性，常用的度量指标有Chao1 丰富度估计量（Chao1 richness estimator） 、香农 - 威纳多样性指数（Shannon-wiener diversity index）、辛普森多样性指数（Simpson diversity index）等。计算菌群丰度：Chao、ace；  计算菌群多样性：Shannon、Simpson。Simpson指数值越大，说明群落多样性越高；Shannon指数越大，说明群落多样性越高。表中显示前10个样本，如果样本大于10个，详见结果目录中的alpha_div.txt。Q: 能不能解释下每个指数（如chao1、shannon）？A: Chao1：是用chao1 算法估计群落中含OTU 数目的指数，chao1 在生态学中常用来估计物种总数，由Chao (1984) 最早提出。Chao1值越大代表物种总数越多。Schao1=Sobs+n1(n1-1)/2(n2+1)其中Schao1为估计的OTU数，Sobs为观测到的OTU数，n1为只有一条序列的OTU数目，n2为只有两条序列的OTU数目。Shannon：用来估算样品中微生物的多样性指数之一。它与 Simpson 多样性指数均为常用的反映 alpha 多样性的指数。Shannon值越大，说明群落多样性越高。Ace：用来估计群落中含有OTU 数目的指数，由Chao 提出，是生态学中估计物种总数的常用指数之一，与Chao1 的算法不同。Simpson：用来估算样品中微生物的多样性指数之一，由Edward Hugh Simpson ( 1949) 提出，在生态学中常用来定量的描述一个区域的生物多样性。Simpson 指数值越大，说明群落多样性越高。辛普森多样性指数=随机取样的两个个体属于不同种的概率=1-随机取样的两个个体属于同种的概率Beta多样性分析（样品间差异分析）Beta多样性度量时空尺度上物种组成的变化, 是生物多样性的重要组成部分, 与许多生态学和进化生物学问题密切相关, 因此在最近10年间成为生物多样性研究的热点问题之一。PCoA分析PCoA（principal co-ordinates analysis）是一种研究数据相似性或差异性的可视化方法，通过一系列的特征值和特征向量进行排序后，选择主要排在前几位的特征值，PCoA 可以找到距离矩阵中最主要的坐标，结果是数据矩阵的一个旋转，它没有改变样品点之间的相互位置关系，只是改变了坐标系统。通过PCoA 可以观察个体或群体间的差异。每一个点代表一个样本，相同颜色的点来自同一个分组，两点之间距离越近表明两者的群落构成差异越小。PCoA有多张图，分别代表的PCoA1-2,2-3,3-1。NMDS分析（非度量多维尺度分析）NMDS（Nonmetric Multidimensional Scaling）常用于比对样本组之间的差异，可以基于进化关系或数量距离矩阵。横轴和纵轴：表示基于进化或者数量距离矩阵的数值 在二维表中成图。与PCA分析的主要差异在于考量了进化上的信息。每一个点代表一个样本，相同颜色的点来自同一个分组，两点之间距离越近表明两者的群落构成差异越小。PCA分析主成分分析PCA（Principal component analysis）是一种研究数据相似性或差异性的可视化方法，通过一系列的特征值和特征向量进行排序后，选择主要的前几位特征值，采取降维的思想，PCA 可以找到距离矩阵中最主要的坐标，结果是数据矩阵的一个旋转，它没有改变样品点之间的相互位置关系，只是改变了坐标系统。详细关于主成分分析的解释推荐大家看一篇文章，http://blog.csdn.net/aywhehe/article/details/5736659 。通过PCA 可以观察个体或群体间的差异。每一个点代表一个样本，相同颜色的点来自同一个分组，两点之间距离越近表明两者的群落构成差异越小。以上三个图可能遇到的问题：1：PCA，PcoA，NMDS分析分别是基于什么数据画的？回答：PCA，PcoA，NMDS分析均是基于OTU分类taxon数据所画，用的是R语言Vegan包中的相关函数画成，其中PcoA与NMDS还要基于样本之间的距离矩阵才能画成。2：PCA分析如果图中大部分点集中在一起，少数点在很远的外围，是什么原因造成的？回答：是因为样本OTU分类时候，少数样本某些菌含量特别高所造成，导致这些样本偏离正常范围，建议单独拿出这些样本观察，看是否是实验错误。3：PCA分析时，不是有PC1，PC2，PC3三个坐标吗？是给出三张图吗？还是三维立体图？回答：PCA作图时，会得出PC1，PC2，PC3三个坐标，可以根据PC12,PC13,PC23分别作图，一般给出的是PC12的图，当PC12图质量不好，看不出明显的样本分类效果时，可以看PC13或PC23的图分类是否清晰，也可以用R语言rgl包做出PC123三维图。QIIME本身结果中有提供PCA的三维图结果，可以通过网页打开。PCA，PcoA，NMDS分析都属于排序分析（Ordination analysis）。排序(ordination)的过程就是在一个可视化的低维空间或平面重新排列这些样本,使得样本之间的距离最大程度地反映出平面散点图内样本之间的关系信息。1、只使用物种组成数据的排序称作非限制性排序(unconstrained ordination)(1)主成分分析(principal components analysis,PCA)(2)对应分析(correspondence analysis, CA)(3)去趋势对应分析(Detrended correspondence analysis, DCA)(3)主坐标分析(principal coordinate analysis, PCoA)(4)非度量多维尺度分析(non-metric multi-dimensional scaling, NMDS)2、同时使用物种和环境因子组成数据的排序叫作限制性排序(constrained ordination)(1)冗余分析(rendancy analysis,RDA)(2)典范对应分析(canonical correspondence analysis, CCA)比较PCA和PCoA：在非限制性排序中，16S和宏基因组数据分析通常用到的是PCA分析和PCoA分析，两者的区别在于：PCA分析是基于原始的物种组成矩阵所做的排序分析，而PCoA分析则是基于由物种组成计算得到的距离矩阵得出的。在PCoA分析中，计算距离矩阵的方法有很多种，包括如：Euclidean, Bray-Curtis, and Jaccard，以及(un)weighted Unifrac (利用各样品序列间的进化信息来计算样品间距离，其中weighted考虑物种的丰度，unweighted没有对物种丰度进行加权处理)。LDA差异贡献分析PCA和LDA的差别在于，PCA，它所作的只是将整组数据整体映射到最方便表示这组数据的坐标轴上，映射时没有利用任何数据内部的分类信息，是无监督的，而LDA是由监督的，增加了种属之间的信息关系后，结合显著性差异标准测试(克鲁斯卡尔-沃利斯检验和两两Wilcoxon测试)和线性判别分析的方法进行特征选择。除了可以检测重要特征，他还可以根据效应值进行功能特性排序，这些功能特性可以解释顶部的大部分生物学差异。详细说明可以参考这篇文章http://blog.csdn.net/sunmenggmail/arti   cle/details/8071502 。不同颜色代表不同样本或组之间的显著差异物种。使用LefSe软件分析获得，其中显著差异的logarithmic LDA score设为2。问题：LDA分析有什么用？回答：组间差异显著物种又可以称作生物标记物（biomarkers），该分析主要是想找到组间在丰度上有显著差异的物种。物种进化树的样本群落分布图是将不同样本的群落构成及分布以物种分类树的形式在一个环图中展示。数据经过分析后，将物种分类树和分类丰度信息通过软件GraPhlAn(http://huttenhower.sph.harvard.e/GraPhlAn )进行绘制。其目的是将物种之间的进化关系以及不同样本的物种分布丰度和最高分布样本的信息在一个视觉集中的环图中一次展示，其提供的信息量较其他图最为丰富。中间为物种进化分类树，不同颜色的分支代表不同的纲（具体的代表颜色见右上角的图例），之后外圈的灰色标示字母的环表示的是本次研究中比例最高的15个科（字母代表的科参见左上角的图例）。之后的外圈提供的是热力图，如果样本数<=10个则绘制样本，如果样本数超过10个则按照分组绘制，每一环为一个样本，根据其丰度绘制的热力图。最外圈为柱状图，绘制的是该属所占比例最高的样本的丰度和样本颜色（样本颜色见环最下方的样本名字的颜色）。其中热力图和柱状图取值均为原比例值x10000后进行log2转换后的值参考文献：1. Vazquez-Baeza Y, Pirrung M, Gonzalez A, Knight R. 2013. Emperor: A tool for visualizing high-throughput microbial community data. Gigascience 2(1):16.2. Legendre, P. and Legendre, L. 1998. Numerical Ecology. Second English Edition. Developments in Environmental Modelling 20. Elsevier, Amsterdam.3. Segata N, Izard J, Waldron L, et al. Metagenomic biomarker discovery and explanation[J]. Genome Biol, 2011, 12(6): R60.4. Langille MGI, Zaneveld J, Caporaso JG, McDonald D, Knights D, Reyes JA et al. (2013). Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nat Biotechnol 31: 814–821.物种相关性分析 根据各个物种在各个样品中的丰度以及变化情况，计算物种之间的相关性，包括正相关和负相关。相关性分析使用CCREPE算法，首先对原始16s测序数据的种属数量进行标准化，然后进行Spearman和Pearson秩相关分析并进行统计检验，计算出各个物种之间的相关性，之后在所有物种中根据simscore绝对值的大小，挑选出相关性最高的前100组数据，基于Cytoscap绘制共表达分析网络图，网络图采用两种不同的形式表现出来。物种相关性网络图A：图中每一个点代表一个物种，存在相关性的物种用连线连接，其中，红色的连线代表负相关，绿色的先代表正相关，连线颜色的深浅代表相关性的高低。         物种相关性网络图B：图中每一个点代表一个物种，点的大小表示与其他物种的关联关系的多少，其中与之有相关性的物种数越多，点的半径和字体越大，连线的粗细代表两物种之间相关性的大小，连线越粗，相关性越高。参考文献：Schwager E, Weingart G, Bielski C, et al. CCREPE: Compositionality Corrected by Permutation and Renormalization[J]. 2014.聚类分析根据OUT数据进行标准化处理（1wlog10）之后，选取数目最多的前60个物种，基于R heatmap进行作图，热图中的每一个色块代表一个样品的一个属的丰度，样品横向排列，属纵向排列，两个热图，差异是是否对样品进行聚类，从聚类中可以了解样品之间的相似性以及属水平上的群落构成相似性。如果聚类结果中出现大面积的白或黑是因为大量的菌含量非常低，导致都没有数值，可以在绘制之前进行标准化操作，对每一类菌单独自身进行Z标准化。群落功能差异分析通过对已有测序微生物基因组的基因功能的构成进行分析后，我们可以通过16s测序获得的物种构成推测样本中的功能基因的构成，从而分析不同样本和分组之间在功能上的差异（PICRUSt Nature Biotechnology, 1-10. 8 2013）。通过对宏基因组测序数据功能分析和对应16s预测功能分析结果的比较发现，此方法的准确性在84%-95%，对肠道微生物菌群和土壤菌群的功能分析接近95%，能非常好的反映样品中的功能基因构成。为了能够通过16s测序数据来准确的预测出功能构成，首先需要对原始16s测序数据的种属数量进行标准化，因为不同的种属菌包含的16s拷贝数不相同。然后将16s的种属构成信息通过构建好的已测序基因组的种属功能基因构成表映射获得预测的功能结果。（根据属这个水平，对不同样本间的物种丰度进行显著性差异两两检验，我们这里的检验方法使用STAMP中的two-sample中T-TEST方法，Pvalue值过滤为0.05，作Extent error bar图。）此处提供COG，KO基因预测以及KEGG代谢途径预测。用户也可自行使用我们提供的文件和软件（STAMP）对不同层级以及不同分组之间进行统计分析和制图，以及选择不同的统计方法和显著性水平。参考文献：Donovan H. Parks1 , Gene W. Tyson,STAMP: statistical analysis of taxonomic and functional profiles, Bioinformatics (2014) 30(21): 3123-3124.doi:10.1093COG构成差异分析图图中不同颜色代表不同的分组，列出了COG构成在组间存在显著差异的功能分类以及在各组的比例，此外右侧还给出了差异的比例和置信区间以及P-value。KEGG代谢途径差异分析图通过KEGG代谢途径的预测差异分析，我们可以了解到不同分组的样品之间在微生物群落的功能基因在代谢途径上的差异，以及变化的高低。为我们了解群落样本的环境适应变化的代谢过程提供一种简便快捷的方法。图解读：图中不同颜色代表不同的分组，列出了在第三层级的构成在组间存在显著差异的KEGG代谢途径第三层分类以及在各组的比例，此外右侧还给出了差异的比例和置信区间以及P-value。本例图所显示的是第三层级的KEGG代谢途径的差异分析，也可以针对第二或第一层的分级进行分析。基因的差异分析图除了能对大的基因功能分类和代谢途径进行预测外，我们还能提供精细的功能基因的数量和构成的预测，以及进行样本间以及组间的差异分析，并给出具有统计意义和置信区间的分析结果。这一分析将我们对于样本群落的差异进一步深入到了每一类基因的层面。 图解读：图中不同颜色代表不同的分组，列出了在组间/样本间存在显著差异的每一个功能基因（酶）以及在各组的比例，此外右侧还给出了差异的比例和置信区间以及P-value。在获得标准报告后如果希望单独修改分组或对某些组之间进行显著性差异分析，可以使用STAMP软件在自己的电脑上进行数据分析。STAMP提供了丰富的统计检验方法和图形化结果的输出。在使用STAMP之前需要首先准备需要的spf格式文件和样品分组信息表。在我们的报告中已经将KEGG和KO以及COG的结果文件后经过转换生成了适用于STAMP软件打开的spf格式文件，还有对应的分组信息表文件groupfile.txt。以下是使用STAMP时的一些相关问题，详细的STAMP使用教程可以参考我们提供的STAMP使用教程。1、  stamp作图用的原始数据的来源？STAMP 可以直接使用来自QIIME的biom文件和PICUST的KEGG和ko 文件，groupfile.txt文件的格式为tab-saperated value (tab键隔开的数据) 2、  分组问题：导入数据之后，viewàgroup legend ,在窗口右侧会出现分组栏，根据需要进行分组。 3、  Unclassiffied选项中，remain Unclassiffied reads、remove Unclassiffied reads、和use only for calculating frequency profiles 方法的区别？remain Unclassiffied reads和use only for calculating frequency profiles方法会保留所有的数据，而remove Unclassiffied reads仅仅保留有确定分组信息的数据。 4、  Statistical test 中，Welch’s t-test、t-test、white’s non-parametric t-test的区别，各自优缺点？为了确保统计学意义和准确度和精确性，需要足够多的样本数目，t-test检验可以在最少样本数为4的时候确保高的准确度和精确性。当两个样本之间具有相同方差的时候，用t-test更为准确，当两个样本没有相同方差，Welch’s t-test更为准确。当样本数目少于8的时候，可以使用white’s non-parametric t-test，该计算时间较长，当样本数目过多的时候不宜使用该方法。5、  Two-group 中type: one side 和 two side 的区别？One side 只会显示前一个group与后一个group差异的比例，而two side 两者之间的比例均会显示。6、 STAMP在使用时首先打开了一个分析文件，如果新打开一个可能会导致显示错误？目前版本的STAMP存在一些小问题，一次分析只能使用一个数据文件，如果要打开新的需要关闭软件后再打开。环境因子分析RDA分析CCA/RDA分析基于对应分析发展的一种排序方法，将对应分析与多元回归分析相结合，每一步计算均与环境因子进行回归，又称多元直接梯度分析。主要用来反映菌群与环境因子之间的关系。RDA 是基于线性模型，CCA是基于单峰模型。分析可以检测环境因子、样品、菌群三者之间的关系或者两两之间的关系。横轴和纵轴：RDA 和CCA 分析，模型不同，横纵坐标上的刻度为每个样品或者物种在与环境因子进行回归分析计算时产生的值，可以绘制于二维图形中。图解读：冗余分析可以基于所有样品的OTU作图，也可以基于样品中优势物种作图；箭头射线：箭头分别代表不同的环境因子；夹角：环境因子之间的夹角为锐角时表示两个环境因子之间呈正相关关系，钝角时呈负相关关系。环境因子的射线越长，说明该影响因子的影响程度越大； 不同颜色的点表示不同组别的样品或者同一组别不同时期的样品，图中的拉丁文代表物种名称，可以将关注的优势物种也纳入图中； 环境因子数量要少于样本数量，同时在分析时，需要提供环境因子的数据，比如 pH值，测定的温度值等。有其他问题可以联系谷禾信息。

今天给大家分享一篇高通量qPCR芯片检测+微生物多样性多组学运用的文章，研究揭示了在长期施肥的情况下土壤微生物多样性对土壤功能和农作物产量的影响，并通过分析筛选得到与农作物产量及土壤营养循环息息相关的关键菌群集合，是一篇微生物多组学应用的优秀案例！原文于2020年10月7日在ISME上在线发表。Biodiversity of key-stone phylotypes determines crop proction in a 4-decade fertilization experiment关键菌群的多样性决定在40年施肥管理下的农作物产量作者：Kunkun Fan1,2, Manuel Delgado-Baquerizo3, Xisheng Guo4, Daozhong Wang4 , Yong-guan Zhu5, Haiyan Chu1,2期刊：ISME时间：2020.10.07影响因子：9.18组学策略：微生物多样性+高通量qPCR芯片检测（碳氮磷硫功能基因芯片）一、文章摘要人类根据农作物种植的需要对土壤进行了数十年的施肥管理，这对陆地生态系统的土壤生产力和功能可能产生了未知的影响，其中一个关键的未知影响是长期施肥管理下土壤生物多样性对农作物产量的调控机制，并且也限制了人类根据土壤生物多样性变化建立农作物生产和土壤健康评估体系。本研究中，作者采用多营养级生态网络研究土壤生态多样性尤其是关键菌群的多样性对土壤功能和小麦产量的潜在影响。分析结果表明，关键菌群的多样性与土壤功能基因丰度和农作物产量之间存在显著正相关，尤其与大部分参与土壤营养循环的功能基因丰度呈正相关，并且关键菌群具有更多参与到氧化还原反应和碳、氮、磷、硫元素循环的功能基因。综上，本研究揭示了在长期施肥的情况下土壤微生物多样性对土壤功能和农作物产量的影响，并通过分析筛选得到与农作物产量及土壤营养循环息息相关的关键菌群集合，可为农作物的可持续种植提供科学依据。二、主要结果1.在长期施肥情况下的微生物群落和功能基因NMDS和ADONIS分析结果表明细菌、真菌、丛枝菌根真菌（AMF）和线虫在不同施肥条件下的群落组成存在显著差异，并且差异程度显著高于土壤和根际土壤之间。作者采用了碳氮磷硫功能基因芯片（共71个基因）对长期施肥管理的土壤进行功能基因检测和定量，发现与碳降解相关的cdh和chiA基因以及与氮固定相关的nifH基因的丰度显著下降。但大部分与碳氮磷硫循环相关的功能基因在氮磷钾肥和牛粪配合使用情况下丰度显著提高，并且在根际土壤中富集。同时结果表明无论是土壤还是根际土壤，土壤功能与小麦产量显著密切相关。2.与土壤功能和农作物产量相关的关键菌群本研究中作者使用生态网络寻找得到4个内部高度相关的微生物集合（Mole #0-3），其中发现Mole#0中的细菌、真菌、AMF和线虫与多种土壤功能基因丰度和农作物产量呈显著正相关（图1.a）。作者将具有重要作用的Mole#0定义为关键菌群，该关键菌群以细菌组成为主，包含多种促进植物生长的相关功能。特别的是，在Mole#0中的菌群之间存在密切正相关（图1.b），同时它们的相对丰度与功能基因的丰度高度正相关（图1.c）。图1.关键菌群网络分析。a：4个主要的微生物群落集合；b：Mole#0中的优势菌群之间的相关性；c：功能基因丰度和不同微生物群落集合的优势菌群的相关性热图。通过系统发育树分析发现相较于其他微生物集合，Mole#0中的细菌倾向在特定的细菌门内聚类。作者进一步从数据库中获取网络分析中的微生物基因组信息，发现在Mole#0中与碳氮磷硫相关的71个功能基因和氧化还原酶基因在基因组中的拷贝数明显高于其他微生物集合。图2.不同微生物集合找那个优势菌群的系统发育树，其中，蓝色代表Mole#0，紫色代表Mole#1，绿色代表Mole#2。3.关键菌群多样性与功能基因及农作物产量之间的关系SEM分析提供进一步的统计证据说明关键菌群多样性对农作物产量和土壤功能的重要性（图3），同时发现在施肥、根际、土壤特性、生物多样性、土壤功能和农作物产量之间存在多种直接或间接的联系。针对所有微生物集合的SEM分析发现可解释75%的小麦产量变异，同时发现细菌多样性与小麦产量成正相关，但真菌和AMF多样性与小麦产量呈负相关。而针对Mole#0中的微生物集合的SEM分析发现可解释79%的小麦产量变异，同时发现关键细菌、真菌和AMF均与小麦产量存在直接正相关。图3.SEM分析解析影响农作物产量的各种因素。三、总 结本研究提供了可靠的证据说明在经过近40年的施肥管理下土壤关键生物的多样性对于农作物种植和土壤功能的重要影响，特别是关键菌群可通过正向调控多种与植物生长和营养循环的微生物功能基因来促进农作物产量。此外，还发现有机肥和化肥的配合使用可抑制病原菌的正常，激活更多对农作物生长有益的微生物。以上的发现说明了关键菌群的多样性对维持土壤功能和农作物产量的重要性，未来有望通过介导农业生态系统中的关键菌群来达到提高农作物产量的目的。从这篇文章可以发现，高通量qPCR芯片检测高精确度、高灵敏度的特点可以更好地对长期施肥管理的土壤进行功能基因检测和定量，高通量qPCR芯片检测与微生物多样性分析相互验证，进一步确定了关键菌群多样性与功能基因及农作物产量之间的关系。美格基因会持续推送高通量qPCR芯片检测案例解读推文，为大家带来高通量qPCR芯片检测案例文章的发文思路。您可能还喜欢：透过3篇CNS读懂宏基因组分析思路，做出好结果发好文！基于GeoChip 5.0对样本中复杂微生物群落的鉴定与多样性分析！更多精彩的高分好文都在美格基因了。