蛋白组学研究方法

蛋白互作技术蛋白质是生物功能最直接的执行者，虽然一些蛋白质可以独立的完成他的使命，但是大部分的蛋白都是需要一些伴侣分子的协助一起完成任务或者形成复合物之后才能充分发挥他的功能。所以，了解蛋白质与蛋白质之间的相互作用，能够帮助我们更好的了解细胞的生命活性，揭示隐藏在表象下的调控机理。经典的蛋白互作研究方法主要包括三个：酵母双杂交、免疫共沉淀、GST-pull down。1. 酵母双杂交技术：主要用来进行互作蛋白的筛选，缺点就是假阳性较高，所以需要进行结果验证，一般可采用免疫共沉淀或GST-pull down实验进行验证。2. 免疫共沉淀：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内相互作用的有效方法。当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。当用预先固化在argarose beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行Western blot检测，进而证明两者间的相互作用。3. GST pull-down实验：是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术。其基本原理是先构建靶蛋白-GST融合蛋白载体，然后进行体外表达及纯化。将得到的靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，充当一种“诱饵蛋白”，然后将目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的蛋白，将目的蛋白洗脱下来，通过SDS-PAGE电泳及western blot分析证实两种蛋白间的相互作用。以上三种方法是比较经典的研究筛选和验证蛋白互作关系的方法。但是也存在一定局限性。酵母双杂交可以大规模的筛选未知的互作蛋白，但是假阳性高，免疫共沉淀及pull down只是对已知的蛋白互作关系进行验证，不能发现新的未知蛋白。免疫沉淀-质谱联用IP-MS技术随着蛋白质组学技术的发展，将免疫亲和与质谱技术结合产生的IP-MS技术则逐渐显示出他的优势。原理是以细胞内源性靶蛋白为诱饵，将靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行共孵育，促进免疫复合物的形成；随后加入能够与抗体结合的protein-A/G（预先结合固化在琼脂小珠上），形成”结合蛋白-靶蛋白-靶蛋白抗体-proteinA/G小珠”复合物，纯化该复合物凝胶电泳分离蛋白，应用质谱分析鉴定靶蛋白的结合蛋白。免疫共沉淀与质谱结合，不仅能验证已知蛋白的相互作用，而且还可以鉴定与目标蛋白互作的未知蛋白，为科学研究提供全新的实验思路。北京百泰派克生物科技有限公司提供蛋白互作，GST pulldown，免疫共沉淀及IP-MS相关服务，欢迎垂询！资料来源：网络资料图片来源：百泰派克生物【biotech-pack】

编者按：在新一年的开端，小鹿首先要祝愿所有的科研工作者新年快乐，愿在这一年中心想事成，科研文章都上榜SCI~~本期，小鹿推出时下热点技术DIA技术，通过热门技术与前沿科技相结合，用3篇影响因子总计66分的文章告诉您DIA技术的应用。DIA技术用于永久定量数字保存对科研研究者来说，科研样本对研究起着决定性的因素。微量样本、独特样本、珍贵样本、甚至有些样本是难以获取的，针对这些样本可能由于研究时间局限性，样本收集不全面，样本失效等损失会带来课题延期、重制样、甚至错失发文先机。本篇由苏黎世联邦理工学院Ruedi Aebersold教授团队在Nature Medicine杂志（IF=30.641）发表题为“Rapid mass spectrometric conversion of tissue biopsy samples into permanent quantitative digital proteome maps”的研究论文，该研究提出了一个方法，可以快速稳定地将组织样本转化为一份数据文档，永久地存贮这个样本经质谱分析得到的蛋白质组结果。影响因子：30.641材料：组织活检样品 发表期刊：Nat.Med.主要技术：PCT-SWATH/DIA中文标题：将组织活检样品快速质谱转换为永久定量数字蛋白质组图谱这篇文章中，作者用PCT-DIA技术方法将来自9个肾癌病人的18个组织切片分别转化为(DIA)SWATH-MS多肽离子碎片谱图，并从这些谱图中对2000个蛋白样本进行定性和定量分析。作者发现肾组织切片的蛋白质组测序结果具有很好的可重复性，而且能完全将肾癌病人和健康人，以及不同组织形态的肾癌亚型区分开来。该方法特别适合大队列（几十上百甚至上千个样品）、少量样品（比如组织活检样品）蛋白组批量分析。2DIA技术在定量准确性和重现性上的优势严格说来：人体各系统器官的疾病都可以在血液当中有一定的呈现，通过测定血液中的蛋白可反映病人的生理病理状态。因此，运用质谱技术来测定蛋白定量的准确性和重现性成了研究的焦点。本文发表在《Theranostics》上由国家蛋白质科学中心的于晓波教授、广东省中医院卢传坚教授、西湖大学郭天南研究员等合作发表的In-depth serum proteomics reveals biomarkers of psoriasis severity and response to traditional Chinese medicin，详细的总结了运用DIA技术对血液标志物进行探索，进一步的验证DIA 技术在定量的准确性和重现性的优势；材料：血清影响因子：8.063发表期刊：Theranostics主要运用技术：DIA技术、抗体微阵列中文标题：血清蛋白质组学鉴定银屑病及其中药疗效的生物标志物英文标题：In-depth serum proteomics reveals biomarkers of psoriasis severity and response to traditional Chinese medicin本文通过DIA技术和抗体微阵列技术，以银屑病为疾病模型，对银屑病治疗前、银屑病中药（银屑灵）治疗后、健康对照共50例血清样本建立蛋白质表达谱。鉴定到了106种参与血液凝固、炎症、细胞凋亡和血管生成等银屑病相关生物过程的差异蛋白。聚类和主成分分析发现58种蛋白可区分健康组和银屑病患者，12种蛋白可预测中药治疗效果，相关性分析发现三个血清蛋白（PI3，CCL22，IL-12B）与银屑病面积和严重程度指数（psoriasis area and severity index, PASI）评分呈正相关。质谱DIA技术适合大规模临床样本的检测，抗体微阵列技术可补充质谱无法鉴定到的血清低丰度蛋白，本文结合DIA技术和抗体微阵列技术研究血液生物标志物的思路值得借鉴。3DIA技术与人工智能相结合2019年11月，英国剑桥大学生物化学系和米尔纳治疗学研究所（Department of Biochemistry and The Milner Therapeutics Institute, University of Cambridge）等多家机构在一区期刊Nature Methods（IF=28.467）发表题为“DIA-NN：通过神经网络和干扰校正实现高通量蛋白质组的深度覆盖”的文章，该文章作者提出了一种方便的集成软件包DIA-NN，它利用深层神经网络和新的量化及信号校正策略来处理DIA蛋白质组学的实验结果。DIA-NN提高了传统DIA蛋白质组定性和定量的能力，特别在高通量应用方面具有快捷的优势，与快速色谱方法结合使用时能够对蛋白质实现准确的深度覆盖。影响因子：28.467发表期刊：Nature Methods运用技术：DIA蛋白质组学中文标题：DIA-NN：通过神经网络和干扰校正实现高通量蛋白质组的深度覆盖软件版本：DIA-NN（1.6.0）、OpenSWATH18、Spectronaut、Specter、Skyline平台：QExactiveTM HF（Thermo Fisher Scientific ）、TripleTOF 6600 (SCIEX)材料：酵母蛋白提取物、人脐带血血浆、酶解的人K562细胞裂解物、Hela细胞蛋白提取物、大肠杆菌蛋白提取物在DIA-NN中引入的计算方法稳定且显著地增加了不同复杂度样品及不同质谱平台上获得定性和准确定量的肽和蛋白质的数量。DIA-NN首次通过使用短色谱梯度实现了蛋白质组的全面覆盖，从而显著缩短了质谱仪的运行时间，为以前无法实现的对高通量蛋白质组进行快速而精确的测量打开了大门。鹿明生物自2017年初建立了DIA、PRM等蛋白组学技术平台，是国内早期开展DIA/PRM技术服务的领跑者；近2余年来，鹿明生物积累了丰富的DIA、PRM蛋白组学等组学项目经验，公司采用高端精密的仪器设备Thermo QE-HF等，迄今为止，鹿明生物已处理DIA+PRM项目样品3000+例，拥有丰富完善的项目经验；目前鹿明生物也已经自主研发了大容量水稻DIA数据库及深度水稻磷酸化DIA数据库、PCT-DIA技术等希望能够为您的科研助力添彩；目前鹿明生物也推出蛋白组学检测+验证一体化--1+1>2的蛋白组学黄金组合服务:DIA +PRM技术，具体可扫码添加技术交流群哦~~鹿明生物上海鹿明生物科技有限公司，一直专注于生命科学和生命技术领域，是国内早期开展以蛋白组和代谢组为基础的多层组学整合实验与分析的团队。经过近数年的发展沉淀，公司建立起了iTRAQ/TMT、DIA、PRM、修饰蛋白组等蛋白组学技术平台和全谱代谢组、靶向代谢组、拟靶向代谢组、脂质组等代谢组学技术平台以及相应的数据整合分析平台，并建立了科学完整的服务流程和精细规范的操作标准。公司拥有：SCIEX-QTRAP-6500,SCIEX-QTRAP-6500 plus，SCIEX-QTRAP-4000,Waters Xevo G2-XS,Thermo-TSQ-Altis,Thermo-Obritrap-QE,Thermo-Obritrap-QE-HF,Aglient-GCMS-7890B/5977A,AglientGCMS7890B/5977A（带顶空进样装置）及云计算分析平台等大型检测设备以及完整的样品前处理系统和数据分析系统（拥有各类分析软件及数据库）。公司荣获国家高新技术企业，通过ISO9001认证，获得代谢组学专利及软件著作等近20余项知识产权专利；同时也取得上海市公共技术服务平台资质认证，获得上海市创新创业计划大赛支持。迄今为止，鹿明完成服务项目上万个，涉及医学、农业、生态学及工业应用等多个研究领域，发表SCI论文数百篇。2017年6月，公司与上海欧易生物医学科技有限公司实现战略整合，实现中心法则上中下游多层组学的串联，整合后的鹿明力求打造优质技术平台，争做优质蛋白代谢服务企业，助力生命科学领域的科学家快出成果，出好成果，从而推动科技创新。鹿明生物，多层组学定制服务专家，为您的科研助力！END

前言2020年7月希伯来大学医学中心Gilad W. Vainer团队在Molecular & Cellular Proteomics发表了题为“Novel Proteome Extraction Method Illustrates a Conserved Immunological Signature of MSI-H Colorectal Tumors”的研究成果，通过建立更为简洁且环保的FFPE样本蛋白提取方法，对微卫星稳定和不稳定的结直肠癌样本进行非标记蛋白质组学分析，结果揭示了肿瘤细胞在长期体内免疫压力下所经历的变化。产生的数据为寻找新的临床生物标志物和治疗方法提供了宝贵资源。中文标题：新型蛋白质组提取方法阐明了MSI-H结直肠肿瘤的保守免疫学特征研究对象：结直肠肿瘤发表期刊：Molecular & Cellular Proteomics影响因子：4.87发表时间：2020年7月运用生物技术：非标记定量蛋白质组学（福尔马林固定和石蜡包埋临床组织样本）研究背景分子病理学的重大突破之一是从福尔马林固定和石蜡包埋（formalin-fixed and paraffin-embedded, FFPE）的临床组织中有效提取DNA和RNA。尽管已有方法可以提取FFPE样本中的蛋白质[1]，但仍然存在诸多问题[2]。主要问题之一是临床中组织固定时间的巨大差异，由于蛋白质的回收率随着固定时间的延长而下降，因此不同的组织固定时间得到的蛋白质组学结果差异较大。建立稳健、有效且不受固定时间影响的蛋白质提取方法将有助于推动临床蛋白质组学的发展。结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是一种常见的癌症，其基因组不稳定是关键的发展因素之一。基因组不稳定性的两种主要形式：染色体不稳定性和微卫星不稳定性（microsatellite instability, MSI）控制着这一过程。大多数CRC病例的特征是染色体不稳定且微卫星稳定（microsatellite stability, MSS）。然而约5-15％的CRC是微卫星高度不稳定性（MSI-H）。MSI-H肿瘤，也称为错配修复缺陷（mismatch repair deficient, MMRd），由DNA错配修复蛋白的缺乏而发展。MSI-H肿瘤会产生可能充当新抗原的异常蛋白，并触发针对肿瘤的有效免疫反应。越来越多的证据表明MSI-H肿瘤细胞与免疫微环境之间存在独特而复杂的相互作用。研究思路研究结果1、FFPE蛋白质组提取的优化临床中福尔马林的固定时间差异较大，较长的固定时间对从临床FFPE样品中提取的蛋白数量产生有害影响，从而影响了质谱检测的蛋白质组覆盖率。本文作者为最小化固定时间对蛋白质组学结果的影响，更改了FFPE蛋白质组提取的几个步骤：1.使用矿物油(mineral oil)进行脱蜡，免除了传统方法中有毒的有机溶剂和多次洗涤。2.升高温度和压力（121c，15psi），有助于蛋白质提取过程。作者将此方法命名为TOP (Temperature-Oil-Pressure)法。作者使用一组在福尔马林中固定2或8天的匹配组织，比较了传统方法和TOP法的蛋白质组结果（每组3次重复）。如图2A示，共鉴定到3988种蛋白质（>3肽段），传统方法8天固定组的蛋白数量最少，Pearson相关性分析表明传统方法8天组与其他组的相关性较低（图2B）。使用12个样品共同鉴定到的2350种蛋白质进行相关性分析也是同样的结果（图2C）。图2 | 与传统提取方法相比，TOP方法对福尔马林固定导致的偏差更具抵抗力（A）蛋白质鉴定数；（B）3988种蛋白的Pearson相关性热图；（C）12个样本中共同鉴定到的2350种蛋白的Pearson相关性热图；2、结直肠癌样本的无监督聚类作者使用TOP法对FFPE结直肠癌样品进行蛋白提取和蛋白质组学非标定量分析。检测的19个样品中8个是MSI-H（42％）。结果共鉴定到4350种蛋白质，其中1664种蛋白质在所有的样本中共同鉴定到。无监督分层聚类显示了两个主要的类别群（图3）。一类包含MSI-H样本（8个中的7个），另一类包含MSS样本（11个中的8个）。且来自同一肿瘤不同区域的样本聚集在一起（样本750和30497；图3）。这些结果表明，优化后的临床蛋白质组学可以产生一致且高质量的数据，并且肿瘤蛋白质组反映了MSI的状态。图3 |无监督层次聚类3、MSI-H肿瘤过表达STAT1和许多免疫相关蛋白差异蛋白分析发现，与MSS组相比，MSI-H组中有67种蛋白上调，35种蛋白下调（图4A）。使用STRING数据库进行蛋白质相互作用分析，发现MSS肿瘤过表达的35种蛋白质没有统计学上的显著富集。而MSI-H过表达的蛋白质具有高度显著的连接富集（图4B）。此外，发现约33％的蛋白质（65种中的22种）与免疫应答过程有关（图4C），特别是与干扰素-γ介导的信号传导途径（图4D）和抗原加工呈递有关。差异蛋白列表中包含STAT1蛋白，这是包括干扰素-γ信号传导在内的许多免疫过程中的关键转录因子。综上所述，MSI-H肿瘤过表达的蛋白质高度富集并与免疫系统有关。图4 | 差异蛋白分析（A）差异蛋白形成的有监督聚类结果；（B）67种MSI-H组过表达蛋白的相互作用；（C）22种蛋白质与免疫应答有关；（D）5种蛋白质与干扰素-γ介导的信号通路有关；4.MSI-H结直肠肿瘤细胞异常表达MHC-II受体为了确定蛋白质组学数据中的差异蛋白是由肿瘤细胞还是基质细胞表达，作者对几种候选蛋白进行了免疫组化分析。由于MHC-II蛋白通常在上皮细胞中不表达，且MSI-H肿瘤细胞中曾报道为阳性，因此作者分析了5个MSS和4个MSI-H肿瘤中MHC-II蛋白的免疫组化（图5A）。结果显示基质淋巴细胞在MSS和MSI-H肿瘤中均表达HLA-DPB1，HLA-DQB1和CD74，其可作为内部阳性对照。但是仅在MSI-H样品中发现了具有弥散性(diffuse)、细胞质(cytoplasmatic)和膜状(membranous)阳性的肿瘤细胞（图5）。免疫组化结果表明免疫学特征主要由肿瘤细胞驱动。此外，它强调了MSI-H肿瘤细胞对MHC-II（免疫检查点LAG-3的配体）的高表达。图5 | 免疫组化表明MSI-H肿瘤细胞表达MHC II型成分5.只有STAT1水平与干扰素-γ信号传导相关人STAT蛋白家族有7个成员。暴露于干扰素-γ后，磷酸化STAT1和STAT3的含量增加，转移到细胞核中起转录激活剂的作用。对Pearson相关矩阵进行无监督聚类，作者发现61种蛋白聚在STAT1附近（图6）。GO功能富集的前三个过程均与免疫相关（图6C）。此外，总STAT1水平与干扰素-γ介导的信号通路和吞噬体相关。对STAT3分析发现聚集了54种蛋白质，但是与STAT3相关的生物学过程和STAT1的完全不同。结果表明STAT家族蛋白与不同的蛋白和生物学过程相关，仅STAT1蛋白水平与区分MSI-H和MSS肿瘤的相同免疫过程相关。图6 | Pearson相关性矩阵的无监督聚类6. 长时间暴露于干扰素-γ可区分STAT1与STAT3接着作者在不断增加的干扰素-γ存在下培养了微卫星不稳定的人CRC细胞DLD1和RKO，观察到STAT1和STAT3的磷酸化水平和总量增加。通过对比短期（1天）或长期（1周）的干扰素-γ暴露，发现一天后总STAT3水平趋于稳定，而在一日暴露和一周暴露之间STAT1水平持续上升（图7A）。接着作者研究了干扰素-γ在癌细胞中诱导的时间蛋白质组学变化。通过对暴露于干扰素-γ一天，一周和对照组的DLD1细胞进行蛋白质组分析，鉴定并定量了包括STAT1和STAT3在内的3771种蛋白质，样本相关性分析表明对照组和IFN-g 1周组显示出最大的差异，而INF-g 1天组在两者之间（图7B）。此外无监督的主成分分析结果与实验设计相匹配（图7C）。图7 | 长期接触IFNg导致STAT1水平继续上调7.暴露于干扰素-γ触发复杂的时间蛋白质组变化对上述3组间进行差异蛋白分析，发现16.1％的蛋白质组（608/3771蛋白）差异表达。这些蛋白质的层次聚类清楚地显示了时间变化（图8），并突出了复杂的时间行为。图8 | 差异表达蛋白的监督层次聚类相关讨论作者优化了FFPE样本提取方法，该方法适用于较宽的福尔马林固定时间。此外，新方法简化了样品制备步骤，且升高的温度和压力有效地溶解了蛋白质。与使用有机溶剂的传统方法相反，TOP方法使用的无害、环保的试剂。从FFPE切割开始约3个小时即可完成蛋白质组提取，且无需通风橱。使用TOP方法和19个FFPE组织，作者建立了结直肠癌临床蛋白质组数据，鉴定和定量超过4100种蛋白质。无监督分层聚类表明MSS和MSI-H患者的蛋白质组是不同的。进一步分析显示大多数由MSI-H肿瘤过表达的蛋白质与免疫系统相关的过程有关，其中包括抗原的加工和呈递。免疫组化结果表明肿瘤细胞而非基质是造成MHC-II异常表达的原因，MHC-II是免疫检查点蛋白LAG-3的配体。值得注意的是， STAT1被MSI-H肿瘤细胞过表达。在结直肠癌中，STAT1的作用是复杂的。MSI-H肿瘤细胞异常表达MHC-II复合物，而STAT1调节CIITA转录（干扰素-γ引起MHC-II表达的关键诱导剂）。综上数据表明STAT1高表达与免疫逃逸之间存在联系。研究结论临床蛋白质组学已显著成熟，优化的流程将继续增进我们对人类疾病的了解。作者通过对FFPE样本提取蛋白流程的优化，结合临床样本证明MSI-H结直肠肿瘤表达高水平的STAT1。研究结果指出了CRC MSI-H肿瘤的一种免疫逃逸机制，该发现可能有助于进一步的药物开发。小鹿推荐临床蛋白质组学对疾病生物标志物、药靶研究、疾病机理、精准医学等研究领域至关重要。FFPE可以在常温保留很久，是医院里最常用的样本储存手段。虽然当前已有FFPE蛋白提取方法，但还存在优化的空间。本文作者针对长时间固定导致FFPE蛋白质组鉴定蛋白数量少的问题，提出了优化的蛋白提取方法。结合临床结直肠癌样本，探索了MSI-H与MSS结直肠癌的蛋白质组学差异，发现了MSI-H肿瘤过表达STAT1和免疫相关蛋白，其提出的FFPE蛋白提取方法和实验思路值得借鉴和参考。文末看点本文对福尔马林固定和石蜡包埋（ FFPE）的临床组织研究，建立稳健、有效且不受固定时间影响的蛋白质提取方法推动了临床蛋白质组学的发展。针对福尔马林固定和石蜡包埋样本鹿明生物也推出了蛋白组学新一代技术PCT-DIA技术，详情请戳【爆品上市】 强力攻克：石蜡/甲醛处理的组织样本及微量样本的蛋白组学难题----PCT-DIA技术。为更好的助力和推动福尔马林固定和石蜡包埋类的微量样本的研究，鹿明生物也推出了联合促销。详情请见下图。参考文献：[1] Ostasiewicz, P., D.F. Zielinska, M. Mann, et al., Proteome, phosphoproteome, and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry. J Proteome Res, 2010. 9(7): p. 3688-700.[2] Giusti, L., C. Angeloni, and A. Lucacchini, Update on proteomic studies of formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Expert Rev Proteomics, 2019. 16(6): p. 513-520.[3] Elez D. Vainer，Juliane KaniaAlmog，Ghadeer Zatara，Yishai Levin，Gilad W. Vainer. Novel Proteome Extraction Method Illustrates a Conserved Immunological Signature of MSI-H Colorectal Tumors. Mol Cell Proteomics. 2020 Oct;19(10):1619-1631.猜你还想看◆微量样本PCT-DIA技术：【爆品上市】 强力攻克：石蜡/甲醛处理的组织样本及微量样本的蛋白组学难题◆微量样本PCT -DIA技术：西湖大学郭天南/李子青团队运用PCT-DIA技术与神经网络机器学习结合分辨良恶性甲状腺结节◆大样本数DIA技术：DIA与AI的结合—NM又发新文（IF:28.467），通过神经网络和干扰校正实现高通量蛋白质组的深度覆盖◆大样本数DIA技术：Nat commu | "深度揭底"大样本DIA磷酸化修饰蛋白组学定量技术END文章来源于鹿明生物

011 蛋白质组学概念的提出早在18世纪，人类就发现了蛋白质这一类型的生物分子，然而直到1938年，瑞典化学家Jons Jakob Berzelius才明确提出了蛋白质的概念，指出蛋白质是由氨基酸组成的一类生物大分子。1949年，英国科学家Frederick Sanger首次测得了蛋白质牛胰岛素的氨基酸序列，并验证了蛋白质由氨基酸组成，他也凭借此项研究成果获得了1958年的诺贝尔化学奖。就在同一年，英国科学家Francis Crick首次提出分子生物学中心法则，这是20世纪生命科学领域最重要的发现之一 ：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）是生物体内遗传信息的载体，DNA以自身为复制模板，通过转录作用将遗传信息传递给核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），成熟的信使RNA（messenger RNA，mRNA）在核糖体上被翻译成一条长肽，然后经折叠加工形成具有生理活性的成熟蛋白。蛋白质是生命的物质基础，作为生物体活动功能的最终直接执行者，对生命活动的实现具有十分重要的作用，参与了生物体内几乎所有的生命活动过程。随着分子生物学技术的发展，蛋白质的诸多功能不断被研究和报道，如蛋白质可以作为离子通道参与信号转导等，人们愈发重视对蛋白质的研究。21世纪初，生命科学领域迎来了一个重要的里程碑——人类基因组草图的绘制完成。2001年由美国、英国、法国、德国、日本和中国科学家共同参与的人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）与Celera基因公司共同公布了人类基因组DNA序列草图，这也代表着人类在生命科学领域迈上了新台阶。2003年该计划的完成可以说是近半个世纪以来最激动人心的一项生命科学成就，它第一次揭示了人类的DNA序列信息，并提供了人类生命信息的蓝图。该研究成果分别发表在Nature、Science两大国际著名期刊上（Lander et al.，2001；Venter et al.，2001）。人类基因组计划因其破解人类遗传密码的里程碑式意义及对于遗传性疾病预防的潜在应用价值，与阿波罗登月计划、曼哈顿原子弹计划一起，并称为自然科学史上的三大计划。随着人类全基因组序列的破译和功能基因组学研究的展开，生命科学家越来越关注如何用基因组研究的模式开展蛋白质组学的研究。因此，Nature、Science在公布人类基因组草图的同时，分别发表了“And now for the proteome”和“Proteomics ingenomeland”的述评与展望（Abbott，2001；Fields，2001）。文中认为蛋白质组学将成为21世纪最大的战略资源，并将成为人类基因争夺战的战略制高点之一，这将蛋白质组学的地位提高到了前所未有的高度。事实上早在1994年，澳大利亚科学家Marc Wilkins便提出了蛋白质组（proteome）这一概念——表征基因组所能表达的全部蛋白。1997年，蛋白质组学（proteomics）的概念产生，其研究的主要内容是细胞、组织或器官内的全部蛋白质。此后该学科迅速发展，并得到了生命科学研究领域的重视。2001年，国际人类蛋白质组组织（Human Proteome Organization，HUPO）正式宣告成立，推动了蛋白质组学研究领域的发展。在2002年国际蛋白质组研讨会上，科学家明确提出了开展 “人类肝脏蛋白质组计划（Human Liver Proteome Project，HLPP）”的建议，并于2003年正式启动，至此人类蛋白质组计划的帷幕正式拉开。该项目也是我国科学家在生命科学领域领导的一次重大国际合作项目。蛋白质组学在细胞的增殖、分化、肿瘤形成等方面的研究中已经取得了不少成果和进展。尤其在癌症研究方面，已经鉴定到了一批肿瘤相关蛋白，这为相关疾病的早期诊断、蛋白质药物靶标的发现、治疗和预后提供了重要依据和线索。022 蛋白质组学的特点人类基因组序列的测定，标志着基因的研究迈上新台阶。随着基因测序技术的改进和成熟，人们对基因的研究更加便捷，对基因的认识也逐渐深入。目前认为可编码蛋白质的基因约20 000个。然而同一个基因可以表达出不同的信使RNA片段，而信使RNA在成熟过程中可能会出现剪切重组等，这显著增加了可表达蛋白的数目。同时，信使RNA翻译出的蛋白质会经历翻译后修饰（Berget，1995；Witze et al.，2007），实现对自身功能的调控，这进一步使蛋白质组的研究复杂化。此外，细胞内表达的蛋白质在时间和空间尺度上具有动态变化的性质，因此细胞内蛋白质的分析远比基因组的分析复杂和具有挑战性。基因组学的研究对象是DNA，DNA的性质较为稳定，且微量的目标样品可以通过PCR技术将其扩增，从而便于研究。目前DNA测序技术已较为成熟，且基因组学的数据库已相对完善，对于基因的研究已经进入了相对成熟的阶段。然而作为基因组后时代，蛋白质组目前尚处于探索和发展阶段。蛋白质组学研究的对象——蛋白质，其本身的性质不够稳定，可能同时存在多种不同的翻译后修饰类型，且其在不同细胞、组织内的表达丰度的动态范围较大。随着高分辨生物质谱技术的迅速发展及基于基因序列的蛋白质数据库的逐步完善，目前已可以实现对蛋白质氨基酸序列的测定，但是仍有大量的内容是未知的，包括蛋白质的定位、蛋白质与小分子的相互作用、蛋白质与蛋白质的相互作用、蛋白质的生命周期等。蛋白质组学的研究，可以从时间和空间角度对细胞、组织的蛋白质进行全面深入的研究，从而深入理解细胞如何利用蛋白质实现各种生理功能的调控。蛋白质组学亟待发展，研究技术也有待进一步发展和提升。033 生物质谱技术科学的进步往往带来技术的革新，而技术的革新会加速科学的发展。在蛋白质组学概念提出后的几年，由于受到研究技术的限制，发展十分缓慢。近些年，高分辨质谱技术（mass spectrometry，MS）的迅速发展，成为了蛋白质组学领域的核心技术。质谱技术是化学领域中研究化合物的一个重要手段。然而，直到软电离离子化技术的出现，才使得用质谱研究生物大分子成为了可能。2002年的诺贝尔化学奖授予美国科学家John Fenn和日本科学家Koichi Tanaka（“The Nobel Prize in Chemistry 2002”。Nobelprize.org. Nobel Media AB 2014. Web. 30 Apr 2015），以表彰他们在将软电离离子化方法用于生物大分子质谱分析方面所作出的贡献。John Fenn发明了电喷雾离子化方法（electrospray ionization，ESI）（Fenn et al.，1989）。样品在毛细管色谱柱中分离，经毛细管柱柱头流出时，在高压电场的作用下形成带电的小液滴。随着液滴的溶剂蒸发，液滴表面离子密度逐渐增大，当达到瑞利（Rayleigh）极限时，液滴发生破裂，形成更小的带电液滴。而后在电场作用下重复蒸发、分裂的过程，直至形成气相离子进入质谱，并被检测。该方法的优点在于可以实现从液态到气态分子的转变，产生的离子可以带有一个或多个电荷。Koichi Tanaka发明的基质辅助激光解析离子化技术（matrix-assisted laser desorption ionization，MALDI）利用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，从而使生物分子电离（Tanaka et al.，1988）。由于电喷雾离子化可形成单电荷离子及多电荷离子而有别于其他的MS离子化技术，并能实现高效液相与质谱的串联。特别是在1994年，Wilm和Mann发展了纳升级喷雾离子源（nano-electrospray ionization source，nanoESI source），与传统的ESI源（流速1～100 L/min）相比，该离子源可以采用更小的溶剂流速（10～500 nL/min），并且电喷雾更稳定，生成的带电液滴更小，能在室温条件下更好地实现去溶剂化（Wilm and Mann，1996），所以在目前的生物质谱中尤其是蛋白质组学研究领域，nanoESI离子化技术应用较为广泛。此外，对于质谱仪而言，质量分析器是其核心部件。随着分辨率和检测速率的提高，质谱仪在蛋白质组学研究中的优势逐渐凸显。目前已有的质量分析器的类型有 ：磁质谱、双聚焦质谱、离子回旋共振质谱、四极杆、四极杆离子阱质谱、时间飞行质谱、傅里叶变换质谱、三重四极杆质谱、线性离子阱质谱、静电轨道场离子回旋加速质谱（Orbitrap）等。其中，Orbitrap无疑是近20年质谱技术中最重要的发明。它极大地缩小了高分辨质量分析器的体积，维护更方便，使得高分辨质谱的台式化和易用化成为了可能，从而便于应用和推广。Thermo公司于2005年推出了第一台商业化的Orbitrap型质谱仪，其分辨率达到了100 000 （m/z 400），最大扫描速度为1.0 Hz。目前高效液相串联质谱在蛋白质和蛋白质的翻译后修饰的鉴定分析方面起着重要的作用，其原理是待测样品经高效液相色谱分离之后，经离子源的离子化，进入质谱。在质谱内通过特定的方式，将母离子碎裂产生碎片离子 ；进一步对碎片离子进行检测，得到该分析物的质谱检测图谱。随后对该图谱进行分析，通过与蛋白质数据库中的理论图谱比对，从而将其氨基酸序列信息和含有的修饰解析出来。质谱技术在生物大分子领域中的应用越来越广，包括定性和定量的高通量蛋白质分析，高通量的蛋白质翻译后修饰分析，鉴定蛋白质-蛋白质相互作用和调控网络，鉴定蛋白质和小分子的相互作用，生物标志物的鉴定和研究等。044 蛋白质组学的研究进展近20年来，蛋白质组学领域的研究技术在不断地革新和提高。1989年，电喷雾离子化技术发明，使得用质谱分析生物大分子成为可能；1993年，肽指纹图谱技术发明，推动了蛋白质鉴定技术的发展 ；1996年，利用二维凝胶电泳技术，实现了对酵母全蛋白的分析 ；2002年，细胞培养稳定同位素标记（stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC）技术发明，使得定量蛋白质组学研究迈上新台阶。1998年，中国启动了“人类肝脏蛋白质组计划”。2010年，中国团队完成肝脏蛋白质组的检测，共鉴定到6788个蛋白质，至此第一个人类器官的全蛋白质组检测工作得以完成（He，2005）。但由于当时的技术局限，所鉴定的蛋白质的数目还远远没有达到理论上肝脏全蛋白质组的蛋白数。近几年来，生物质谱技术进一步发展，其检测灵敏度和分辨率明显提高，扫描速度也有了显著提升，已经具备了高通量深度蛋白质组学研究的条件。因而，关于全蛋白质表达谱研究工作的报道越来越多。基于质谱的飞速发展，科研工作者目前已经对细胞内的不同细胞器做了组学研究，包括线粒体、高尔基体、细胞核等。蛋白质组学领域的知名科学家Matthias Mann在2008年报道了用一个月的时间鉴定了接近8000个蛋白质的成果（Hubner et al.，2008）。2011年，经过样品制备方法的创新、色谱分离方法的优化和质谱仪器的升级，Mann团队通过利用样品处理新方法FASP（flter-aided sample preparation）对小鼠的肝脏组织进行蛋白质组学研究，最终在21 d质谱数据采集时间内鉴定了高于10 000个蛋白质（Wisniewski et al.，2011），这是目前最具深度的蛋白质组学研究之一。随着质谱仪准确度、分辨率和扫描速度的不断提高，Mann实验室在2014年利用Q Exactive超高分辨率质谱仪，在4 d时间内定量分析了小鼠肝脏组织样本中的11 520个蛋白质（Azimifar et al.，2014）。因此随着样品制备方法、色谱分离方法及质谱仪器的不断优化和创新，科学家可以对生物体内的蛋白质进行更具深度的鉴定，从而更加深入地研究生命活动中的生理生化过程。2014年，国际著名杂志Nature子刊Nature Methods评述了近10年内的自然科学研究领域方法，基于质谱的蛋白质组学技术便是其中之一（Ten years of Methods，2014），可见质谱的发展对自然科学研究领域产生了极为重要的影响。当然，组学的研究并非仅仅是蛋白质测序，还包括了组学定量、靶向蛋白质组的研究等。其中靶向蛋白质组的研究被列入了Nature Methods 2012年度生命科学研究的方法学进展。2014年对于蛋白质组学的研究来说是具有里程碑意义的一年。4月，国际顶级期刊Nature首次报道了两篇关于接近完整的人类蛋白质组表达谱草图的文章。其中一篇文章收集了30种人类正常组织和细胞样本，包括成人和胎儿的组织及血液细胞，最终共鉴定到17 294个基因编码的蛋白，占总编码蛋白基因数的84%（Kim et al.，2014）。另外一篇文章，则综合了已发表的公共数据集及其实验室已有的数据，包括数十种人类组织、体液样本及细胞株等的鉴定分析结果，共鉴定到18 097个基因编码蛋白，占总编码蛋白基因数的92%（Wilhelm et al.，2014）。以上两篇文章共同绘制出了第一张人类蛋白质草图。近些年，中国蛋白质组学研究领域也在快速发展。2014年，“中国人蛋白质组草图计划”（CNHPP）这一科技部的重点项目正式展开，计划绘制包括心脏、肝脏、肺、肾脏等在内的10个最重要人体器官的蛋白质组生理和病理图谱，旨在以中国重大疾病的防治需求为牵引，发展蛋白质组研究相关设备及关键技术，构建中国人类蛋白质组的“百科全书”。055 蛋白质组学的应用通过基因组测序和分析，可以发现多种诱发癌症的驱动基因。2013年在Science杂志上发表了题为“Cancer genome landscape”的综述（Vogelstein et al.，2013），提出大部分癌症的发生是由于2～8个驱动基因突变，人体内目前认知到的癌症驱动基因共有约140个。尽管如此，驱动基因突变并不能解释所有癌症发生发展的现象。例如，2014年Nature杂志上发表的对230例肺腺癌临床样本的研究结果称，部分样本的基因组测序结果未能解释信号通路被激活的现象（The Cancer Genome Atlas Research Network，2014）。为了加深对癌症发生发展机制的认识，迫切需要对癌症进行深入的蛋白质组学研究，从而从蛋白质水平阐释癌症可能的发生发展机制。2006年年初，美国国立癌症研究院（National Cancer Institute，NCI）开始了一项为期5年，耗资1.04亿美元的临床蛋白质组肿瘤分析联盟（Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium，CPTAC）（Ellis et al.，2013），其目的在于建立应用于癌症诊断、治疗和预防的蛋白质组学技术，建立数据分析标准流程及试剂、参考物质的应用等系统，从而达到拓宽蛋白质组学技术在临床癌症诊断中的应用。目前该项目已经取得了非常出色的进展，其中一项工作为对被TCGA项目（The Cancer Genome Atlas）表征的95个结肠和直肠癌样本进行了深入的蛋白质组学及生物信息学分析，从蛋白质组学层面对结肠、直肠癌进行分型。在所得的5种蛋白质分型中，其中的两种与TCGA的一种转录本亚型——“微卫星不稳定亚型/CpG岛甲基化表型亚型”有重叠部分，但也发现了与之明显不同的基因突变、DNA甲基化和蛋白质表达图谱，这些都具有不同的临床表现，为临床疾病的研究提供了新的思路和检测指标（Zhang et al.，2014）。蛋白质组学在人类疾病中的研究应用已经在一些疾病中开展，如癌症、皮肤病、心脏病等。研究包括寻找与疾病相关的单个蛋白，整体研究某种疾病引起的蛋白质表达或修饰水平的变化，利用蛋白质组寻找一些致病微生物引起的疾病的诊断标记和疫苗等。随着精准医疗时代的到来，蛋白质组学在药物研究、临床诊断和个性化治疗等方面将具有更为广阔的应用前景。

深科·浅说蛋白质组研究：生命天书的新解码？前不久，《自然》杂志在线发表了中国科学家在早期肝细胞癌蛋白质组研究领域取得的重大科研成果。这一研究测定了早期肝细胞癌的蛋白质组表达谱和磷酸化蛋白质组图谱，发现了肝细胞癌精准治疗的潜在新靶点——胆固醇酯化酶SOAT1。90%以上的肝癌属于肝细胞癌。对于普通人来说，这一研究最耀眼的成绩，是给治疗最凶险的一类肝细胞癌带来了希望；对于蛋白质组相关科研人员来说，这一成果是“中国人类蛋白质组计划迎来的第一道曙光”。该成果论文的通讯作者、国家蛋白质科学中心（北京）首席科学家贺福初院士认为：“这一成果证明，基因组学不能独打天下，现在轮到蛋白质组学上场了。”回顾此前有关癌症的研究成果，“基因”这个词是在抗癌场景中出现的高频词——科学家相信：人类的某些基因隐藏着打开癌症开关的钥匙。这一思路符合学界对基因组学的一贯期待，贺福初院士介绍：“人们1985年开始酝酿基因组计划的主要动力，就是希望能够通过描绘和破解基因蓝图，揭示人类生老病死的规律和本质。”但人们将基因图谱这本“天书”印出来后，发现解读“天书”依旧是一大难题。1994年澳大利亚科学家Marc Wikins首先提出蛋白质组学这一概念。简单来说，基因承载着人类的遗传物质，而蛋白质是遗传物质传递的最后一个环节，是生命活动的执行者，蛋白质是组成人体所有细胞和组织的重要成分。一个生物系统在特定状态下表达的所有种类的蛋白质就是蛋白质组。1998年，“认为基因组学的发展或许遇到了瓶颈”的贺福初开始转向蛋白质组学研究。2002年，贺福初成为“国际人类蛋白质组计划”的重要参与者，并带领中国科学家牵头实施人类肝脏蛋白质组计划，他相信“基因组学解决不了的问题，或许蛋白质组学能解决”。目前贺福初团队的研究思路与一些美国同行不同。据介绍，贺福初团队的思路是用蛋白质组学驱动的精准医学“领跑”国际精准医疗；而美国的研究主流策略是“蛋白基因组学”，即将蛋白质组的数据用于基因组的注释，蛋白质组的研究仍然需要“背靠”基因组、转录组。科学家们对蛋白质组学研究的价值存在争议。贺福初说，学界更为主流的观点是，蛋白质组学的研究只是基因组学研究的“注解”。而贺福初认为蛋白组研究不是基因组研究的“附庸”。以本次发表在《自然》杂志在线的研究为例，他希望更多人认同蛋白质组研究的价值和作用。贺福初团队的这项研究持续了5年。研究发现，在最凶险的一类肝细胞癌中，胆固醇稳态失调与病发有直接联系，具体来说，胆固醇酯化酶越活跃，这类患者的手术后复发或死亡风险越大。而如果胆固醇酯化酶SOAT1得到抑制，肿瘤的增殖和迁移能力也同时受到有效抑制。他们的研究还发现，胆固醇酯化酶SOAT1在头颈癌、胃癌、前列腺癌、肾癌和甲状腺癌中均和患者较差的术后转移和死亡表现正相关。贺福初认为，这种基于蛋白质组研究的“抗代谢失稳”的抗癌思路，或可成为继抗增殖抗癌疗法和免疫抑制抗癌疗法之后的抗癌新方向。在前不久举行的成果发布会上，施普林格 自然旗下自然科研大中华区总监保罗 埃文斯在祝贺视频中说：“《自然》杂志约有93%的拒稿率，因此这样一篇论文发表出来是一项很大的成就，我深信这项研究工作将为蛋白质组学所引导的精准医学的发展作出有力贡献。”“蛋白组是解读生命天书的利器。”该成果的第一作者、军事科学院军事医学研究院研究员姜颖相信：“蛋白质组学驱动的精准医学时代正向我们走来。”据悉，此前在“蛋白基因组学”研究模式的指导下，美国等国的科学家们已经完成的精准医疗分子分型包括：结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌和胃癌等。张茜 来源：中国青年报

随着生物科技的迅速发展，每天都会有海量的生物学数据产生，如何有效的分析这些“生物学大数据”？生物信息学的应用变得尤为重要，在生物领域从基因测序，到基因编辑，再到基因疗法的精准医疗，由生物科技引发的又一场变革正悄然而至。试问大家做好准备迎接它到来了吗？本次分享的主题为：如何快速获取海量数据？我们就从物种的DNA或蛋白质序列说起，在我们的科学研究中下载序列是一件简单不过的事情，无非就是联网NCBI等主页上，选择数据库后输入AC号或GI号后直接下载。如果是少量的序列数据，我们可以通过一个个ID去查找，复制，粘贴方式保存到本地文件中。但是如何大批量下载数据呢？再通过复制、粘贴方法虽然很精确但是对于大批量的数据下载效率实在是太低了。是否可以直接下载数据库准备好的序列文件？或者编写程序脚本进行批量下载？本次小鹿分享的是2种热门物种（人和鼠）的无编程基础的下载方式。（我们后面会分享“如何使用代码批量下载生物学序列数据”） 物种 人 1.NCBI的GenBank数据库基因：MYH9物种：人Homo sapiens（1）用浏览器登录NCBI数据库官网：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/（2）数据库选择框：选择Gene；在搜索框输入：MYH9，可以添加Homo sapiens或者Human，这样匹配更准确；（3）点击MYH9 - myosin heavy chain 9，选择FASTA格式；（4）点击下载MYH9基因序列NCBI Reference Sequence: NC_000022.11，起个合适的文件名，推荐使用基因名或者数据库登录号；（5）物种基因组和蛋白组序列的下载选择Genome子数据库，同样在搜索框输入物种英文名或拉丁学名，例如，输入human，我们查找人的基因组数据，如下所示：点击下载基因组或蛋白组FASTA序列，直接会弹出下载链接，选择保存文件的位置即可开始下载；还可以下载NCBI上的基因组注释GFF文件（Ensembl数据库也可以下载物种的GFF文件，后面会给大家讲到）物种 人和小鼠 2.Uniprot数据库样例蛋白：P35579物种：人Homo sapiens和小鼠Mus musculus（1）用浏览器登录Uniprot数据库官网：https://www.uniprot.org/（2）搜索框输入：P35579，点击Search；（3）查看P35579蛋白的生物学信息：肌球蛋白9（Myosin-9）；可以看到该蛋白主要分布在细胞基质中，是细胞的动力蛋白；（4）下载序列数据，点击FASTA；（5）下载物种蛋白质组序列文件（例如下载物种：小鼠mus musculus）；在Uniprot数据库官网选择Proteomes子库，然后在搜索框输入：mus musculus，选择Organism ID为10090的小鼠；点击Protein Count: 55462，显示小鼠蛋白Entry，可以根据需要定制自己需要的数据：例如，我们需要GeneID，点击Columns进行个性化的定制；如下所示：点击Download下载所需要的数据，选择文件格式。如果我们需要的是表格数据，我们通常下载为Tab分割符（Tab-separated）的txt文件，因为Excel表格有最大行数的限制，如果超出最大行数会导致数据丢失；如果是序列文件，我们选择下载FASTA格式的文件；物种 人 3.Ensembl(Ensembl Genome Browser）数据库物种：人Homo sapiens（1）使用浏览器登录数据数据库：https://asia.ensembl.org/index.html（2）选择Human数据库，如下所示：（3）选择下载基因组序列，见下图：（4）在Ensembl数据库下载物种的GFF文件前面我们讲到了在NCBI数据库中下载物种基因组注释GFF文件，其实我们还可以在Ensembl数据库中下载物种的注释文件，而且在Ensembl中下载的GFF文件更加标准，使用起来更方便。（5）直接连接到ensembl的FTP服务器，网址：ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-100/fasta/homo_sapiens/dna/选择toplevel标签的序列文件进行下载，如下所示：小鹿后面还会分享“如何使用代码批量下载生物学序列数据”哦，请关注鹿明生物，get最新分享热文。 猜你还想看◆生信分析：你可以更美一些：SnapGene Viewer软件序列可视化操作◆云平台：震惊！他花了3分钟就完成了我三个周的工作!◆云平台：欧易/鹿明云 | 免费的聚类热图不试试吗？◆生信分析：这个R包不太冷系列——GOplot（功能富集绘图）◆生信分析：10行代码让你的相关性图貌美如花◆生信分析：对话百年名画--文章绘图配色高级又简单！◆生信分析：只需3分钟Get“代谢通路分析神器”◆生信分析：玩转生信—火山图中“亿点细节”，你会打造吗？◆生信分析：【指南】Cytoscape之stringAPP蛋白互作分析详解◆生信分析：【教程】组学研究，用python快速实现PCA分析和绘图◆生信分析：组学研究，R语言实用技巧—热图，运用pheatmap包简单易懂快速汇图方法来袭~◆生信分析：【情人节】R语言—小提琴图的浪漫邂逅END文章来源于鹿明生物

前言特拉维夫大学Tamar Geiger（Tamar Geiger课题组一直致力于使用高精度质谱的方法鉴定肿瘤治疗的潜在靶点）教授团队和Sheba医疗中心的Gal Markel团队合作在Cell发表的题为“Proteomics of Melanoma Response to Immunotherapy Reveals Mitochondrial Dependence”的研究成果，通过蛋白质组学技术和功能验证，发现了黑色素瘤细胞的代谢状态通过抗原呈递机制的内在变化和肿瘤微环境的外在变化影响了T细胞杀伤，揭示了黑色素瘤代谢状态与免疫治疗响应之间的关联，这可能有助于将来改善免疫治疗响应。中文标题：黑色素瘤对免疫治疗响应的蛋白质组学研究揭示线粒体依赖性研究对象：黑色素瘤发表期刊：Cell影响因子：38.637运用生物技术：蛋白质组学研究背景免疫疗法彻底改变了转移性黑色素瘤患者的治疗方法，极大地提高了患者的生存率。迄今为止，这种成功很大程度上归因于黑色素瘤的高突变负荷。目前，免疫检查点抑制剂（ICIs）被认为是黑色素瘤免疫治疗的主要手段，尤其是针对CTLA-4或PD1免疫检查点的抗体，但约有50％患者对治疗无反应。肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的过继细胞疗法（ACT）是一种不同的免疫治疗策略，在黑色素瘤治疗中显示出很高的疗效。当前人们已投入大量精力来确定预测性反应指标和揭示耐药机制，但主要是使用组织学、基因组学和转录组学方法，尚还缺少对黑色素瘤进行深入的蛋白质组学分析。研究思路研究结果1.黑色素瘤对TIL和抗PD1响应的蛋白质组学分析为了鉴定与免疫治疗响应相关的蛋白质网络，作者收集了116个IV期黑色素瘤样本，包括42例接受TIL治疗的患者和74例接受抗PD1治疗的患者，并进行了蛋白质组分析。作者将每个队列分为响应组（包括部分响应者和完全响应者；n = 61）和无响应组（进行性疾病；n = 48）。PD1队列包括其他疾病稳定的患者（n = 7）（图1A）。对患者临床参数的检查表明，响应者和无响应者在总体生存率上存在显著差异（图1B）。年龄和BRAF突变状态在两组之间均无显著差异。此外，先前的靶向治疗（n = 16）或抗CTLA-4（n = 29）治疗均未显示出与响应相关。在TIL队列中发现性别之间存在显著相关性，并且在响应者中血浆LDH水平低于两个队列中的非响应者（p值<0.005；卡方检验）。对于蛋白质组学分析，作者解剖了>80％肿瘤细胞的黑色素瘤区域。为了获得准确的蛋白质组定量，作者设计了一种super-SILAC混合物，该混合物由5种SILAC标记的黑色素瘤细胞系组成，可作为标准化的参考。然后将混合物以1：1的蛋白质比例掺入每个黑色素瘤样品中，以用作定量参考。混合的蛋白裂解液经酶切和分馏后，用Q-Exactive Plus或HF质谱仪进行检测（图1C）。结果共定量到10,376种蛋白质，响应者和非响应者之间的覆盖范围没有明显差异（图1D-1E）。进一步过滤保留至少70％的样品中鉴定出的蛋白质，这些蛋白中包括800多种与信号转导相关的蛋白以及数十种受体和转录因子相关的蛋白，表明它们足以覆盖细胞内过程的分析。图1 | 黑色素瘤对免疫治疗响应的蛋白质组学2.免疫疗法响应者和无响应者的功能分析作者通过Student t检验在TIL治疗和抗PD1治疗人群中分别鉴定了414和636个响应者和无响应者间的差异表达蛋白。通路Proteomaps基于KEGG注释对两组差异蛋白进行聚类，发现两种治疗方法的图谱有惊人的相似之处（图2A）。在这两种治疗方法下，响应组均以较高水平的代谢蛋白为主，而非响应组则为剪接体和RNA代谢相关蛋白为主。除代谢类别外，两种治疗方法的响应组均具有更高比例的抗原呈递以及信号传导相关蛋白。与两种疗法之间的通路高度相似性相一致，二维注释富集分析结果表明两种疗法富集类别有着高相关性（R = 0.76）。在这两种治疗中，响应组的线粒体代谢通路都显著富集（图2B）。鉴于两种疗法的响应组谱图在功能上相似，作者使用所有116例样本的数据集，进行了WGCNA分析。结果中得到了一组与患者无进展生存期，完全或部分响应以及血浆LDH水平呈正相关的模块。与之前的结果一致，这些模块富集到了抗原呈递，IFNG信号以及线粒体代谢通路（图2C）。总而言之，这些分析强调了线粒体代谢的差异通常与免疫治疗反应相关。图2 | 免疫疗法响应者和无响应者间的功能差异3.鉴定免疫治疗响应的蛋白质标志物为了鉴定与响应有关的特征蛋白，作者使用基于SVM的分类方法（基于ANOVA的特征排序），在TIL治疗队列筛选出8个特征蛋白，其中6个在响应组中上调，2个下调（图3A）。在抗PD1治疗队列中筛选出15种特征蛋白，所有特征蛋白均在响应组上调（图3B）。两组特征蛋白没有重叠，TIL治疗队列包括与脂肪酸和酮体代谢有关的蛋白质，抗PD1治疗特征蛋白由多种抗原呈递相关蛋白组成。统计分析表明抗PD1队列的15种特征蛋白质中，有12种具有统计学意义（图3C）。总体而言，作者在抗PD1治疗队列中发现了95种显著变化的蛋白质，其中83种在响应组中上调。由于TIL队列较小，因此没有显著变化的蛋白质。为了提高分析的统计能力，作者合并了两个队列，发现响应者和非响应者之间有160种显著变化的蛋白质（图3D）。图3 | 响应于免疫治疗的特征蛋白构建响应蛋白的相互作用网络得到两个高度连接的蛋白簇。第一个蛋白簇富集了IFN，抗原加工和呈递机制蛋白。第二个蛋白簇富集了参与脂质代谢和TCA循环的线粒体代谢酶（图4A–4C）。因此，尽管蛋白不一定在两种治疗情况下都能预测反应，但线粒体-IFN网络与两种治疗都相关。TIL队列中六个上调的特征蛋白在抗PD1队列中也上调（图4D）。类似地，抗PD1队列的15种特征蛋白中的10种在TIL队列中也显示出相似的趋势。重要的是，TIL响应组中MHC相关蛋白和抗原呈递机制蛋白均高于无响应组（图4E）。接下来，作者分析了特征蛋白与无进展生存期（PFS）的关系。Kaplan Meier分析显示在TIL队列中，ACAT1，SUPV3L1和HTATIP2的高表达与更长的PFS正相关（图4F）。在抗PD1队列中，大多数特征蛋白与更长的PFS显著相关。对每个特征蛋白在另一个队列中的分析表明，它们几乎与存活率无关（图4F）。图4 | 免疫治疗响应的综合分析蛋白质组学结果将黑色素瘤的代谢状态与抗原呈递和IFN信号传导相关联。鉴于这些分析可能已平均了来自不同细胞群体的信号，作者通过连续切片的免疫组化检查了关键特征蛋白在组织水平上的空间表达。免疫组化结果与蛋白质组学数据一致，这些蛋白在响应组和非响应组间的表达有着显著差异，并且这些蛋白是在黑色素瘤细胞中特异性染色（图5A和5B）。线粒体标志物和电子传输链（ETC）组分SDHA的染色在响应组的线粒体中显著增加（图5C）。作者接着检查了代谢蛋白表达与T细胞浸润之间的关联（图5C和5D）。与这些患者中更高的疗效相一致，作者发现CD8或CD3 T细胞染色与特征蛋白ACOT1，ACAT1和HADHA之间具有高度相关性（图5C）。总而言之，这些结果证明肿瘤线粒体代谢与细胞免疫原性之间存在明确的联系，这值得进行下游功能研究。图5 | 代谢蛋白和T细胞浸润的组织水平验证4. 黑色素瘤细胞免疫原性代谢调控的功能验证除了代谢特征和免疫响应之间的相关性之外，作者考虑线粒体代谢是否在增加肿瘤免疫原性方面具有功能性作用。为了诱导增加培养细胞的线粒体呼吸，作者用丙酮酸脱氢酶激酶的抑制剂二氯乙酸（DCA）处理了四种黑色素瘤细胞系，这增加了进入线粒体的碳通量。经DCA处理的细胞蛋白质组学分析显示，涉及抗原呈递的多种蛋白质表达增加（图6A）。在MHC I类蛋白中，大多数DCA处理后的黑色素瘤细胞系中HLA-A表达略有降低，而HLA-B和HLA-C显著升高，并且主要的抗原呈递因子TAP1，TAP2和B2M在不同的细胞系中显示出不同的行为。根据蛋白质组学结果，作者发现DCA处理可增加细胞表面HLA的表达，并增加mRNA表达水平（图6B-6D）。这些结果表明代谢状态不仅与治疗的响应相关，而且在增加总体抗原呈递方面具有调节作用。为了直接在特征蛋白和抗原呈递之间建立联系，作者使用了CRISPR-Cas9系统在WM266-4和Mel526黑色素瘤细胞系中敲除了两个TIL特征基因ACAT1和HADHA。此外，在同种细胞中敲除了脂肪酸氧化的主要调节剂CPT1A。蛋白质组学分析显示，与敲除细胞相比，对照组中的抗原呈递和IFN信号以及氧化磷酸化和电子传递链过程显著富集（图6E）。对基因扰动的下游影响的研究表明，在Mel526细胞中敲除ACAT1，HADHA或CPT1A后，MHC I类强度降低，HLA II类呈递细胞百分比降低（图6F，6G）。蛋白质组学分析进一步验证了这些结果，并显示了其他关键抗原呈递机制蛋白在两组间具有更高的比值（图6H）。这些结果表明，即使是TIL特征蛋白中的单个线粒体蛋白也可以影响抗原呈递机制和MHC I类表达。图6 | 抗原呈递的代谢控制代谢对抗原呈递的作用说明这些可能影响T细胞识别和肿瘤细胞杀伤。为了检验这一假设，作者将敲除组或对照组黑色素瘤细胞与匹配的T细胞共培养，并通过LDH分泌监测细胞死亡。与抗原呈递机制蛋白下调相一致，在ACAT1，HADHA和CPT1A敲除后，特异性T细胞的杀伤力明显降低（图7A）。为了通过体内小鼠模型检查这些效应，作者敲除了小鼠黑色素瘤细胞系YUMMER1.7中的Acat1，并监测其对免疫活性小鼠的肿瘤生长和免疫浸润的影响。结果表明敲除Acat1后肿瘤生长显著增加（图7B）。基于体外观察结果，作者假设敲除Acat1减少了T细胞识别，从而促进了肿瘤的进展。实际上，敲除Acat1的肿瘤细胞在RNA和蛋白质水平上均显示MHC I类和PD1配体（Pdl1）表达的显著降低（图7C–7F）。此外，与IFNG一起孵育24小时后，敲除细胞显示出对MHC I类，Pdl1和B2m的诱导作用降低（图7G）。免疫细胞谱分析显示，与对照相比，敲除Acat1的肿瘤中细胞因子产生的T细胞（cytokine-procing T cells）水平较低（图7H和7I），而浸润CD4 +和CD8 + T细胞的总百分比没有变化（图7I-7L）。此外，敲除Acat1的肿瘤中单核细胞髓样细胞（monocytic myeloid cells）的比例显著低于对照（图7M），而巨噬细胞的比例显著上升（图7N）。总的来说，这些结果说明了这些蛋白质作为影响黑色素瘤和免疫细胞调节剂的重要性。图7 | CRISPR敲除对肿瘤免疫原性和T细胞活性的影响研究结论免疫疗法彻底改变了癌症的治疗方法，但是大多数患者没有响应。本文通过蛋白质组学研究来自肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）治疗或抗PD1免疫治疗的晚期黑色素瘤患者的临床样品。统计分析表明在两种治疗中，响应组的氧化磷酸化和脂质代谢均高于非响应组。为了阐明代谢状态对免疫响应的影响，作者在代谢扰动或CRISPR-Cas9敲除后检查了黑色素瘤细胞。这些实验结果表明脂质代谢是通过提高抗原呈递而增加黑素瘤免疫原性，从而增加了对T细胞杀伤的敏感性。总的来说，蛋白质组学分析揭示了黑色素瘤代谢状态与免疫治疗响应之间的关联，这可能有助于将来改善治疗响应。小鹿推荐本文作者通过对两种免疫疗法患者组织样本的蛋白质组学分析，提出黑色素瘤细胞的代谢状态通过抗原呈递机制的内在变化和肿瘤微环境的外在变化来影响T细胞杀伤。这些结果为复杂的免疫代谢网络增加了新的认知，这可能具有重要的治疗意义。蛋白质组学在肿瘤研究领域进展迅猛，已有多种肿瘤的研究成果发表于顶级学术期刊。本文也又一次证明了蛋白质组学在生命科研领域研究中的重要作用。鹿明生物上海鹿明生物科技有限公司，一直专注于生命科学和生命技术领域，是国内早期开展以蛋白组和代谢组为基础的多层组学整合实验与分析的团队。经过近数年的发展沉淀，公司建立起了iTRAQ/TMT、4D-DIA、4D-PRM、修饰蛋白组学等蛋白组学技术平台,同时为加强学术交流，鹿明生物公众号也会一直为各位老师分享更多科研干货，欢迎关注鹿明生物官微哦~~猜你还想看◆蛋白质组学前处理方法大揭秘！学会了这几招之后“包治百病”~◆盘点 | 医学方向2020年度最佳项目文章TOP5，总影响因子：61.414◆跨年项目文章 | 两篇连发~转录组+蛋白组学对水生生物中纳米塑料毒性机理研究◆项目文章 | iTRAQ定量蛋白组学助力南京农大茶树抗寒机制研究END文章来源于鹿明生物

复旦团队创建精准N糖蛋白质组学分析方法央广网上海9月6日消息（记者傅闻捷）近日，复旦大学生物医学研究院和化学系教授杨芃原团队、中国科学院计算技术研究所研究员贺思敏团队以及国家蛋白质科学中心（上海）研究员黄超兰团队合作，发表了基于质谱的高通量糖基化肽段分析方法pGlyco2.0，为精准N糖蛋白质组学提供了新技术。昨天，相关研究成果以《pGlyco2.0：基于综合质控和一步质谱法的精准N糖蛋白质组学糖肽分析方法》（pGlyco 2.0 enables precision N-glycoproteomics with comprehensive quality control and one-step mass spectrometry for intact glycopeptide identification）为题在《自然·通讯》（Nature Communications）上发表。杨芃原、贺思敏和黄超兰为共同通讯作者。杨芃原为该文的Lead Contact。pGlyco2.0流程图糖基化是最复杂的蛋白后修饰之一。与其他蛋白后修饰相比，糖基化不但会产生宏观不均一性（每个蛋白上可能有多个后修饰位点），更会产生海量的微观不均一性（每个位点上可能有几十甚至上百种不同的后修饰基团）。除此之外，糖链本身的离子化效率很低。这些因素的结合使得糖基化分析的通量和质量远低于蛋白质组学的常规分析水平。该研究通过深入研究和测试质谱条件，开发基于阶梯能量的一步质谱采集法，提高了糖肽鉴定的通量和开发具有自主产权的pGlyco2.0糖肽检索引擎，从糖链、肽段、糖肽三个层面对糖肽数据库检索进行精确质控，从而大幅提升了N糖蛋白质组学分析的通量和质量。基于重标技术的糖肽质控新方法此外，该研究首次将重标元素应用于糖肽鉴定准确度分析，为该领域的质控分析提供了新的方法及标准。最后，该研究报道了目前最大的糖基化数据集：在1%的假阳性率下，该研究在小鼠的五个脏器种鉴定到了超过一万条N糖肽。

#BioArt植物#撰文 | 春晓责编 | 兮Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order.—— 诺贝尔生理学或医学奖获得者Sydney Brenner单细胞蛋白质组学在蛋白丰度检测、转录修饰和翻译后修饰方面填补了单细胞转录组学的空白。单细胞蛋白质组学质谱（SCoPE-MS）是近年来兴起的一种定量分析多功能单细胞蛋白质组的方法，这种方法采用同位素标记和载体蛋白质组学来分析单个细胞【1】。同位素标记具有相同质量的化学标签，其中包含了独特的质量条码，这些条码能够通过肽片段化显示出来，进而进行定量分析，它的优点是所有样品中的肽在质谱图中均显示一个峰，从而增加了信号强度，并且能够同时分离肽离子【2】（图1） 图1. 图解单细胞蛋白质组学质谱技术SCoPE-MS利用这一特性，通过将“载体”样品加入单细胞蛋白质组100倍至200倍水平，可以分析单细胞蛋白质组【1,3】。虽然这项技术的出现令人鼓舞，但是当载体蛋白质组加入的量过高时，从单细胞组获得的数据准确性和它的生物学结论都大打折扣。近日，来自Genentech的Christopher M. Rose与慕尼黑工业大学Bernhard Kuster团队合作在Nature Methods杂志上发表题为Defining the carrier proteome limit for single-cell proteomics的研究论文，这篇论文给出了载体蛋白质组水平和SCoPE-MS定量准确性之间的关系，为未来单细胞蛋白质组学的实验设计、数据收集和数据分析提供了指导，同时作者介绍了自己研发的程序SCPComponsion，这个程序能够对单细胞蛋白质组学质谱进行快速的质量控制分析。首先，作者对HeLa细胞胰酶消化液进行同位素标记好后从1：1到1：100000稀释了10个样，分别于同水平参考样进行比对，找到了定量的动态范围。同时，作者发现了“载体蛋白质组效应”：为了保持质谱实验中定量的准确性，载体蛋白质组的水平和采样离子的数量都需要增加，但是高水平的载体蛋白质组可能导致单细胞离子采样不足。为了更好地了解载体蛋白质组水平增加对单细胞信号检测的影响，作者通过评估离子取样、定量动态范围和multiplexing水平来表征复杂生物样品的变化，结果发现以上三种变化和取样离子数有关。基于以上结果，在ScoPE-MS实验中保持定量准确度的主要因素是单细胞通道离子的充分采样。选择好仪器参数和分析后定量SNR滤波可以提高SCoPE-MS实验得出的生物学结论准确性。最后，作者介绍了他们做的一个软件工具，叫SCPComponion（单细胞蛋白质组学伴侣），它可以快速分析用户提供的SCP-MS数据，进行参数分析和数据特征的检测（https://www.github.com/scp-ms/SCPCompanion）（图2）。图2. SCPCompanion的图形用户界面单细胞蛋白质组的质谱检测中，载体蛋白质组的引入本身就带有争议，但是作者的新方法能够通过优化仪器参数后，即便在载体蛋白质组水平较高的情况下也可以准确地定量数据。目前，单细胞蛋白质组学尚处于初级阶段，与单细胞RNA序列分析相比深度有限。RNA测序技术无法检测翻译后事件（如磷酸化或降解），而SCP-MS检测深度可以增加到约5000个蛋白质，这种检测深度能够和单细胞RNA测序相媲美，并可能为未来单细胞分析添加重要的信息。新的SCoPE-MS方法再次增加了SCP-MS的分析深度，同时读者可以参考SCPComponion软件对检测数据进行评估和分析。作者预测下一代单分子蛋白质测序方法的重大进展可能会基于非质谱技术。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41592-020-01002-5参考文献1. Budnik, B., Levy, E., Harmange, G. & Slavov, N. SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifes proteome heterogeneity ring cell diferentiation. Genome Biol. 19, 161 (2018).2. Bakalarski, C. E. & Kirkpatrick, D. S. A biologist’s feld guide to multiplexed quantitative proteomics. Mol. Cell. Proteomics 15, 1489–1497 (2016).3. Specht, H., Emmott, E., Koller, T. & Slavov, N. High-throughput single-cell proteomics quantifes the emergence of macrophage heterogeneity. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/665307 (2019).