蛋白质组研究鉴定

编者按：在新一年的开端，小鹿首先要祝愿所有的科研工作者新年快乐，愿在这一年中心想事成，科研文章都上榜SCI~~本期，小鹿推出时下热点技术DIA技术，通过热门技术与前沿科技相结合，用3篇影响因子总计66分的文章告诉您DIA技术的应用。DIA技术用于永久定量数字保存对科研研究者来说，科研样本对研究起着决定性的因素。微量样本、独特样本、珍贵样本、甚至有些样本是难以获取的，针对这些样本可能由于研究时间局限性，样本收集不全面，样本失效等损失会带来课题延期、重制样、甚至错失发文先机。本篇由苏黎世联邦理工学院Ruedi Aebersold教授团队在Nature Medicine杂志（IF=30.641）发表题为“Rapid mass spectrometric conversion of tissue biopsy samples into permanent quantitative digital proteome maps”的研究论文，该研究提出了一个方法，可以快速稳定地将组织样本转化为一份数据文档，永久地存贮这个样本经质谱分析得到的蛋白质组结果。影响因子：30.641材料：组织活检样品 发表期刊：Nat.Med.主要技术：PCT-SWATH/DIA中文标题：将组织活检样品快速质谱转换为永久定量数字蛋白质组图谱这篇文章中，作者用PCT-DIA技术方法将来自9个肾癌病人的18个组织切片分别转化为(DIA)SWATH-MS多肽离子碎片谱图，并从这些谱图中对2000个蛋白样本进行定性和定量分析。作者发现肾组织切片的蛋白质组测序结果具有很好的可重复性，而且能完全将肾癌病人和健康人，以及不同组织形态的肾癌亚型区分开来。该方法特别适合大队列（几十上百甚至上千个样品）、少量样品（比如组织活检样品）蛋白组批量分析。2DIA技术在定量准确性和重现性上的优势严格说来：人体各系统器官的疾病都可以在血液当中有一定的呈现，通过测定血液中的蛋白可反映病人的生理病理状态。因此，运用质谱技术来测定蛋白定量的准确性和重现性成了研究的焦点。本文发表在《Theranostics》上由国家蛋白质科学中心的于晓波教授、广东省中医院卢传坚教授、西湖大学郭天南研究员等合作发表的In-depth serum proteomics reveals biomarkers of psoriasis severity and response to traditional Chinese medicin，详细的总结了运用DIA技术对血液标志物进行探索，进一步的验证DIA 技术在定量的准确性和重现性的优势；材料：血清影响因子：8.063发表期刊：Theranostics主要运用技术：DIA技术、抗体微阵列中文标题：血清蛋白质组学鉴定银屑病及其中药疗效的生物标志物英文标题：In-depth serum proteomics reveals biomarkers of psoriasis severity and response to traditional Chinese medicin本文通过DIA技术和抗体微阵列技术，以银屑病为疾病模型，对银屑病治疗前、银屑病中药（银屑灵）治疗后、健康对照共50例血清样本建立蛋白质表达谱。鉴定到了106种参与血液凝固、炎症、细胞凋亡和血管生成等银屑病相关生物过程的差异蛋白。聚类和主成分分析发现58种蛋白可区分健康组和银屑病患者，12种蛋白可预测中药治疗效果，相关性分析发现三个血清蛋白（PI3，CCL22，IL-12B）与银屑病面积和严重程度指数（psoriasis area and severity index, PASI）评分呈正相关。质谱DIA技术适合大规模临床样本的检测，抗体微阵列技术可补充质谱无法鉴定到的血清低丰度蛋白，本文结合DIA技术和抗体微阵列技术研究血液生物标志物的思路值得借鉴。3DIA技术与人工智能相结合2019年11月，英国剑桥大学生物化学系和米尔纳治疗学研究所（Department of Biochemistry and The Milner Therapeutics Institute, University of Cambridge）等多家机构在一区期刊Nature Methods（IF=28.467）发表题为“DIA-NN：通过神经网络和干扰校正实现高通量蛋白质组的深度覆盖”的文章，该文章作者提出了一种方便的集成软件包DIA-NN，它利用深层神经网络和新的量化及信号校正策略来处理DIA蛋白质组学的实验结果。DIA-NN提高了传统DIA蛋白质组定性和定量的能力，特别在高通量应用方面具有快捷的优势，与快速色谱方法结合使用时能够对蛋白质实现准确的深度覆盖。影响因子：28.467发表期刊：Nature Methods运用技术：DIA蛋白质组学中文标题：DIA-NN：通过神经网络和干扰校正实现高通量蛋白质组的深度覆盖软件版本：DIA-NN（1.6.0）、OpenSWATH18、Spectronaut、Specter、Skyline平台：QExactiveTM HF（Thermo Fisher Scientific ）、TripleTOF 6600 (SCIEX)材料：酵母蛋白提取物、人脐带血血浆、酶解的人K562细胞裂解物、Hela细胞蛋白提取物、大肠杆菌蛋白提取物在DIA-NN中引入的计算方法稳定且显著地增加了不同复杂度样品及不同质谱平台上获得定性和准确定量的肽和蛋白质的数量。DIA-NN首次通过使用短色谱梯度实现了蛋白质组的全面覆盖，从而显著缩短了质谱仪的运行时间，为以前无法实现的对高通量蛋白质组进行快速而精确的测量打开了大门。鹿明生物自2017年初建立了DIA、PRM等蛋白组学技术平台，是国内早期开展DIA/PRM技术服务的领跑者；近2余年来，鹿明生物积累了丰富的DIA、PRM蛋白组学等组学项目经验，公司采用高端精密的仪器设备Thermo QE-HF等，迄今为止，鹿明生物已处理DIA+PRM项目样品3000+例，拥有丰富完善的项目经验；目前鹿明生物也已经自主研发了大容量水稻DIA数据库及深度水稻磷酸化DIA数据库、PCT-DIA技术等希望能够为您的科研助力添彩；目前鹿明生物也推出蛋白组学检测+验证一体化--1+1>2的蛋白组学黄金组合服务:DIA +PRM技术，具体可扫码添加技术交流群哦~~鹿明生物上海鹿明生物科技有限公司，一直专注于生命科学和生命技术领域，是国内早期开展以蛋白组和代谢组为基础的多层组学整合实验与分析的团队。经过近数年的发展沉淀，公司建立起了iTRAQ/TMT、DIA、PRM、修饰蛋白组等蛋白组学技术平台和全谱代谢组、靶向代谢组、拟靶向代谢组、脂质组等代谢组学技术平台以及相应的数据整合分析平台，并建立了科学完整的服务流程和精细规范的操作标准。公司拥有：SCIEX-QTRAP-6500,SCIEX-QTRAP-6500 plus，SCIEX-QTRAP-4000,Waters Xevo G2-XS,Thermo-TSQ-Altis,Thermo-Obritrap-QE,Thermo-Obritrap-QE-HF,Aglient-GCMS-7890B/5977A,AglientGCMS7890B/5977A（带顶空进样装置）及云计算分析平台等大型检测设备以及完整的样品前处理系统和数据分析系统（拥有各类分析软件及数据库）。公司荣获国家高新技术企业，通过ISO9001认证，获得代谢组学专利及软件著作等近20余项知识产权专利；同时也取得上海市公共技术服务平台资质认证，获得上海市创新创业计划大赛支持。迄今为止，鹿明完成服务项目上万个，涉及医学、农业、生态学及工业应用等多个研究领域，发表SCI论文数百篇。2017年6月，公司与上海欧易生物医学科技有限公司实现战略整合，实现中心法则上中下游多层组学的串联，整合后的鹿明力求打造优质技术平台，争做优质蛋白代谢服务企业，助力生命科学领域的科学家快出成果，出好成果，从而推动科技创新。鹿明生物，多层组学定制服务专家，为您的科研助力！END

MRM技术流程（来源：百泰派克生物）质谱多反应监测MRM蛋白鉴定技术作为一种高特异性、高灵敏度的质谱数据获取方式，在进行蛋白质组学更具针对性的研究中发挥了重要作用，受到很多研究者们的关注。质谱多反应监测MRM蛋白鉴定技术是基于已知信息或假定信息设定质谱检测规则，对符合规则的离子进行信号记录，去除大量不符合规则离子信号的干扰，从而得到质谱信息的一种数据获取方式。具体地说，即使根据多肽母离子质量数和碎片离子质量数，选择母离子-子离子对，允许符合设定的母离子进入碰撞室，碰撞完成后，只记录设定子离子信号。通过母离子和子离子的两次选择，去除干扰离子，降低化学背景，提高灵敏度。通过与其他质谱扫描技术的联合使用，质谱多反应监测MRM蛋白鉴定技术能在蛋白质研究中充分展现其高灵敏度、高准确性、高重复性、高通量的应用有点。质谱多反应监测MRM蛋白鉴定技术的特点1. 灵敏度高：质谱多反应监测MRM蛋白鉴定技术通过两级离子选择，排除了大量干扰离子，使质谱的化学背景大大降低。目标检测物的信噪比显著提高，能够完成其他质谱扫描方式所望尘莫及的高灵敏度检测。2. 重现性好：质谱信号重现性差在一定程度上是因为复杂生物样本基体和共流出组分对待测分子离子化、质谱信号的抑制及源内碰撞碎裂过程的影响导致。而在质谱多反应监测MRM蛋白鉴定技术质谱信号采集中，后两者的影响被大大降低，因此重现性也相应提高。3. 准确度高：利用质谱多反应监测MRM蛋白鉴定技术特异性，对符合设定的多肽进行检测，并且进一步进行增强产物扫描分析，得到高分辨的串联质谱碎片数据，分析过程中的定性结果假阳性率大大降低。该技术与中性丢失相比，后者易检测到一些产生相似质量丢失的假阳性肽，而一些不易产生中性丢失的目标肽也有可能没被检测。而质谱多反应监测MRM蛋白鉴定技术则寻找产生特异碎片的特异母离子，鉴定准确度高于全扫描和中性丢失质谱扫描模式。4. 通量高：使用目前最先进的质谱系统，质谱多反应监测MRM蛋白鉴定技术每个工作循环能处理多达300对母离子-子离子，这种特点为研究多种蛋白质组学的多种修饰和丰度变化提供了机会，更能满足蛋白质组学的研究需求。质谱多反应监测MRM蛋白鉴定技术可应用于生物标志物检测、蛋白质翻译后修饰研究、定量蛋白质组学研究等。百泰派克生物科技采用AB SCIEX TripleTOF 5600，AB SCIEX Triple Quad 5500，Q Exactive, Fusion质谱平台结合Nano-LC，提供一站式质谱多反应监测MRM蛋白鉴定技术定量蛋白分析服务。包括MRM方法建立和优化、特异肽段挑选、同位素标记肽段、质谱分析、原始数据分析、生物信息学分析。

011 蛋白质组学概念的提出早在18世纪，人类就发现了蛋白质这一类型的生物分子，然而直到1938年，瑞典化学家Jons Jakob Berzelius才明确提出了蛋白质的概念，指出蛋白质是由氨基酸组成的一类生物大分子。1949年，英国科学家Frederick Sanger首次测得了蛋白质牛胰岛素的氨基酸序列，并验证了蛋白质由氨基酸组成，他也凭借此项研究成果获得了1958年的诺贝尔化学奖。就在同一年，英国科学家Francis Crick首次提出分子生物学中心法则，这是20世纪生命科学领域最重要的发现之一 ：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）是生物体内遗传信息的载体，DNA以自身为复制模板，通过转录作用将遗传信息传递给核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），成熟的信使RNA（messenger RNA，mRNA）在核糖体上被翻译成一条长肽，然后经折叠加工形成具有生理活性的成熟蛋白。蛋白质是生命的物质基础，作为生物体活动功能的最终直接执行者，对生命活动的实现具有十分重要的作用，参与了生物体内几乎所有的生命活动过程。随着分子生物学技术的发展，蛋白质的诸多功能不断被研究和报道，如蛋白质可以作为离子通道参与信号转导等，人们愈发重视对蛋白质的研究。21世纪初，生命科学领域迎来了一个重要的里程碑——人类基因组草图的绘制完成。2001年由美国、英国、法国、德国、日本和中国科学家共同参与的人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）与Celera基因公司共同公布了人类基因组DNA序列草图，这也代表着人类在生命科学领域迈上了新台阶。2003年该计划的完成可以说是近半个世纪以来最激动人心的一项生命科学成就，它第一次揭示了人类的DNA序列信息，并提供了人类生命信息的蓝图。该研究成果分别发表在Nature、Science两大国际著名期刊上（Lander et al.，2001；Venter et al.，2001）。人类基因组计划因其破解人类遗传密码的里程碑式意义及对于遗传性疾病预防的潜在应用价值，与阿波罗登月计划、曼哈顿原子弹计划一起，并称为自然科学史上的三大计划。随着人类全基因组序列的破译和功能基因组学研究的展开，生命科学家越来越关注如何用基因组研究的模式开展蛋白质组学的研究。因此，Nature、Science在公布人类基因组草图的同时，分别发表了“And now for the proteome”和“Proteomics ingenomeland”的述评与展望（Abbott，2001；Fields，2001）。文中认为蛋白质组学将成为21世纪最大的战略资源，并将成为人类基因争夺战的战略制高点之一，这将蛋白质组学的地位提高到了前所未有的高度。事实上早在1994年，澳大利亚科学家Marc Wilkins便提出了蛋白质组（proteome）这一概念——表征基因组所能表达的全部蛋白。1997年，蛋白质组学（proteomics）的概念产生，其研究的主要内容是细胞、组织或器官内的全部蛋白质。此后该学科迅速发展，并得到了生命科学研究领域的重视。2001年，国际人类蛋白质组组织（Human Proteome Organization，HUPO）正式宣告成立，推动了蛋白质组学研究领域的发展。在2002年国际蛋白质组研讨会上，科学家明确提出了开展 “人类肝脏蛋白质组计划（Human Liver Proteome Project，HLPP）”的建议，并于2003年正式启动，至此人类蛋白质组计划的帷幕正式拉开。该项目也是我国科学家在生命科学领域领导的一次重大国际合作项目。蛋白质组学在细胞的增殖、分化、肿瘤形成等方面的研究中已经取得了不少成果和进展。尤其在癌症研究方面，已经鉴定到了一批肿瘤相关蛋白，这为相关疾病的早期诊断、蛋白质药物靶标的发现、治疗和预后提供了重要依据和线索。022 蛋白质组学的特点人类基因组序列的测定，标志着基因的研究迈上新台阶。随着基因测序技术的改进和成熟，人们对基因的研究更加便捷，对基因的认识也逐渐深入。目前认为可编码蛋白质的基因约20 000个。然而同一个基因可以表达出不同的信使RNA片段，而信使RNA在成熟过程中可能会出现剪切重组等，这显著增加了可表达蛋白的数目。同时，信使RNA翻译出的蛋白质会经历翻译后修饰（Berget，1995；Witze et al.，2007），实现对自身功能的调控，这进一步使蛋白质组的研究复杂化。此外，细胞内表达的蛋白质在时间和空间尺度上具有动态变化的性质，因此细胞内蛋白质的分析远比基因组的分析复杂和具有挑战性。基因组学的研究对象是DNA，DNA的性质较为稳定，且微量的目标样品可以通过PCR技术将其扩增，从而便于研究。目前DNA测序技术已较为成熟，且基因组学的数据库已相对完善，对于基因的研究已经进入了相对成熟的阶段。然而作为基因组后时代，蛋白质组目前尚处于探索和发展阶段。蛋白质组学研究的对象——蛋白质，其本身的性质不够稳定，可能同时存在多种不同的翻译后修饰类型，且其在不同细胞、组织内的表达丰度的动态范围较大。随着高分辨生物质谱技术的迅速发展及基于基因序列的蛋白质数据库的逐步完善，目前已可以实现对蛋白质氨基酸序列的测定，但是仍有大量的内容是未知的，包括蛋白质的定位、蛋白质与小分子的相互作用、蛋白质与蛋白质的相互作用、蛋白质的生命周期等。蛋白质组学的研究，可以从时间和空间角度对细胞、组织的蛋白质进行全面深入的研究，从而深入理解细胞如何利用蛋白质实现各种生理功能的调控。蛋白质组学亟待发展，研究技术也有待进一步发展和提升。033 生物质谱技术科学的进步往往带来技术的革新，而技术的革新会加速科学的发展。在蛋白质组学概念提出后的几年，由于受到研究技术的限制，发展十分缓慢。近些年，高分辨质谱技术（mass spectrometry，MS）的迅速发展，成为了蛋白质组学领域的核心技术。质谱技术是化学领域中研究化合物的一个重要手段。然而，直到软电离离子化技术的出现，才使得用质谱研究生物大分子成为了可能。2002年的诺贝尔化学奖授予美国科学家John Fenn和日本科学家Koichi Tanaka（“The Nobel Prize in Chemistry 2002”。Nobelprize.org. Nobel Media AB 2014. Web. 30 Apr 2015），以表彰他们在将软电离离子化方法用于生物大分子质谱分析方面所作出的贡献。John Fenn发明了电喷雾离子化方法（electrospray ionization，ESI）（Fenn et al.，1989）。样品在毛细管色谱柱中分离，经毛细管柱柱头流出时，在高压电场的作用下形成带电的小液滴。随着液滴的溶剂蒸发，液滴表面离子密度逐渐增大，当达到瑞利（Rayleigh）极限时，液滴发生破裂，形成更小的带电液滴。而后在电场作用下重复蒸发、分裂的过程，直至形成气相离子进入质谱，并被检测。该方法的优点在于可以实现从液态到气态分子的转变，产生的离子可以带有一个或多个电荷。Koichi Tanaka发明的基质辅助激光解析离子化技术（matrix-assisted laser desorption ionization，MALDI）利用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，从而使生物分子电离（Tanaka et al.，1988）。由于电喷雾离子化可形成单电荷离子及多电荷离子而有别于其他的MS离子化技术，并能实现高效液相与质谱的串联。特别是在1994年，Wilm和Mann发展了纳升级喷雾离子源（nano-electrospray ionization source，nanoESI source），与传统的ESI源（流速1～100 L/min）相比，该离子源可以采用更小的溶剂流速（10～500 nL/min），并且电喷雾更稳定，生成的带电液滴更小，能在室温条件下更好地实现去溶剂化（Wilm and Mann，1996），所以在目前的生物质谱中尤其是蛋白质组学研究领域，nanoESI离子化技术应用较为广泛。此外，对于质谱仪而言，质量分析器是其核心部件。随着分辨率和检测速率的提高，质谱仪在蛋白质组学研究中的优势逐渐凸显。目前已有的质量分析器的类型有 ：磁质谱、双聚焦质谱、离子回旋共振质谱、四极杆、四极杆离子阱质谱、时间飞行质谱、傅里叶变换质谱、三重四极杆质谱、线性离子阱质谱、静电轨道场离子回旋加速质谱（Orbitrap）等。其中，Orbitrap无疑是近20年质谱技术中最重要的发明。它极大地缩小了高分辨质量分析器的体积，维护更方便，使得高分辨质谱的台式化和易用化成为了可能，从而便于应用和推广。Thermo公司于2005年推出了第一台商业化的Orbitrap型质谱仪，其分辨率达到了100 000 （m/z 400），最大扫描速度为1.0 Hz。目前高效液相串联质谱在蛋白质和蛋白质的翻译后修饰的鉴定分析方面起着重要的作用，其原理是待测样品经高效液相色谱分离之后，经离子源的离子化，进入质谱。在质谱内通过特定的方式，将母离子碎裂产生碎片离子 ；进一步对碎片离子进行检测，得到该分析物的质谱检测图谱。随后对该图谱进行分析，通过与蛋白质数据库中的理论图谱比对，从而将其氨基酸序列信息和含有的修饰解析出来。质谱技术在生物大分子领域中的应用越来越广，包括定性和定量的高通量蛋白质分析，高通量的蛋白质翻译后修饰分析，鉴定蛋白质-蛋白质相互作用和调控网络，鉴定蛋白质和小分子的相互作用，生物标志物的鉴定和研究等。044 蛋白质组学的研究进展近20年来，蛋白质组学领域的研究技术在不断地革新和提高。1989年，电喷雾离子化技术发明，使得用质谱分析生物大分子成为可能；1993年，肽指纹图谱技术发明，推动了蛋白质鉴定技术的发展 ；1996年，利用二维凝胶电泳技术，实现了对酵母全蛋白的分析 ；2002年，细胞培养稳定同位素标记（stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC）技术发明，使得定量蛋白质组学研究迈上新台阶。1998年，中国启动了“人类肝脏蛋白质组计划”。2010年，中国团队完成肝脏蛋白质组的检测，共鉴定到6788个蛋白质，至此第一个人类器官的全蛋白质组检测工作得以完成（He，2005）。但由于当时的技术局限，所鉴定的蛋白质的数目还远远没有达到理论上肝脏全蛋白质组的蛋白数。近几年来，生物质谱技术进一步发展，其检测灵敏度和分辨率明显提高，扫描速度也有了显著提升，已经具备了高通量深度蛋白质组学研究的条件。因而，关于全蛋白质表达谱研究工作的报道越来越多。基于质谱的飞速发展，科研工作者目前已经对细胞内的不同细胞器做了组学研究，包括线粒体、高尔基体、细胞核等。蛋白质组学领域的知名科学家Matthias Mann在2008年报道了用一个月的时间鉴定了接近8000个蛋白质的成果（Hubner et al.，2008）。2011年，经过样品制备方法的创新、色谱分离方法的优化和质谱仪器的升级，Mann团队通过利用样品处理新方法FASP（flter-aided sample preparation）对小鼠的肝脏组织进行蛋白质组学研究，最终在21 d质谱数据采集时间内鉴定了高于10 000个蛋白质（Wisniewski et al.，2011），这是目前最具深度的蛋白质组学研究之一。随着质谱仪准确度、分辨率和扫描速度的不断提高，Mann实验室在2014年利用Q Exactive超高分辨率质谱仪，在4 d时间内定量分析了小鼠肝脏组织样本中的11 520个蛋白质（Azimifar et al.，2014）。因此随着样品制备方法、色谱分离方法及质谱仪器的不断优化和创新，科学家可以对生物体内的蛋白质进行更具深度的鉴定，从而更加深入地研究生命活动中的生理生化过程。2014年，国际著名杂志Nature子刊Nature Methods评述了近10年内的自然科学研究领域方法，基于质谱的蛋白质组学技术便是其中之一（Ten years of Methods，2014），可见质谱的发展对自然科学研究领域产生了极为重要的影响。当然，组学的研究并非仅仅是蛋白质测序，还包括了组学定量、靶向蛋白质组的研究等。其中靶向蛋白质组的研究被列入了Nature Methods 2012年度生命科学研究的方法学进展。2014年对于蛋白质组学的研究来说是具有里程碑意义的一年。4月，国际顶级期刊Nature首次报道了两篇关于接近完整的人类蛋白质组表达谱草图的文章。其中一篇文章收集了30种人类正常组织和细胞样本，包括成人和胎儿的组织及血液细胞，最终共鉴定到17 294个基因编码的蛋白，占总编码蛋白基因数的84%（Kim et al.，2014）。另外一篇文章，则综合了已发表的公共数据集及其实验室已有的数据，包括数十种人类组织、体液样本及细胞株等的鉴定分析结果，共鉴定到18 097个基因编码蛋白，占总编码蛋白基因数的92%（Wilhelm et al.，2014）。以上两篇文章共同绘制出了第一张人类蛋白质草图。近些年，中国蛋白质组学研究领域也在快速发展。2014年，“中国人蛋白质组草图计划”（CNHPP）这一科技部的重点项目正式展开，计划绘制包括心脏、肝脏、肺、肾脏等在内的10个最重要人体器官的蛋白质组生理和病理图谱，旨在以中国重大疾病的防治需求为牵引，发展蛋白质组研究相关设备及关键技术，构建中国人类蛋白质组的“百科全书”。055 蛋白质组学的应用通过基因组测序和分析，可以发现多种诱发癌症的驱动基因。2013年在Science杂志上发表了题为“Cancer genome landscape”的综述（Vogelstein et al.，2013），提出大部分癌症的发生是由于2～8个驱动基因突变，人体内目前认知到的癌症驱动基因共有约140个。尽管如此，驱动基因突变并不能解释所有癌症发生发展的现象。例如，2014年Nature杂志上发表的对230例肺腺癌临床样本的研究结果称，部分样本的基因组测序结果未能解释信号通路被激活的现象（The Cancer Genome Atlas Research Network，2014）。为了加深对癌症发生发展机制的认识，迫切需要对癌症进行深入的蛋白质组学研究，从而从蛋白质水平阐释癌症可能的发生发展机制。2006年年初，美国国立癌症研究院（National Cancer Institute，NCI）开始了一项为期5年，耗资1.04亿美元的临床蛋白质组肿瘤分析联盟（Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium，CPTAC）（Ellis et al.，2013），其目的在于建立应用于癌症诊断、治疗和预防的蛋白质组学技术，建立数据分析标准流程及试剂、参考物质的应用等系统，从而达到拓宽蛋白质组学技术在临床癌症诊断中的应用。目前该项目已经取得了非常出色的进展，其中一项工作为对被TCGA项目（The Cancer Genome Atlas）表征的95个结肠和直肠癌样本进行了深入的蛋白质组学及生物信息学分析，从蛋白质组学层面对结肠、直肠癌进行分型。在所得的5种蛋白质分型中，其中的两种与TCGA的一种转录本亚型——“微卫星不稳定亚型/CpG岛甲基化表型亚型”有重叠部分，但也发现了与之明显不同的基因突变、DNA甲基化和蛋白质表达图谱，这些都具有不同的临床表现，为临床疾病的研究提供了新的思路和检测指标（Zhang et al.，2014）。蛋白质组学在人类疾病中的研究应用已经在一些疾病中开展，如癌症、皮肤病、心脏病等。研究包括寻找与疾病相关的单个蛋白，整体研究某种疾病引起的蛋白质表达或修饰水平的变化，利用蛋白质组寻找一些致病微生物引起的疾病的诊断标记和疫苗等。随着精准医疗时代的到来，蛋白质组学在药物研究、临床诊断和个性化治疗等方面将具有更为广阔的应用前景。

来源：ChemicalBook背景[1-5]定量蛋白质组学服务是一种用于确定样品中蛋白质含量的分析化学技术服务。蛋白质鉴定的方法与一般（定性）蛋白质组学中使用的方法相同，但把量化作为附加维度。定量蛋白质组学不是仅仅提供在某个样品中鉴定的蛋白质列表，而是产生关于两个生物样品之间的生理差异的信息。例如，该方法可用于比较来自健康和患病患者的样品。定量蛋白质组学主要通过二维凝胶电泳进行（2-DE）或质谱（MS）。然而，最近开发的定量斑点印迹（QDB）分析方法能够以高通量形式测量样品中单个蛋白质的绝对量和相对量，从而为蛋白质组学研究开辟了新的方向。与需要MS进行下游蛋白质鉴定的2-DE相比，MS技术不仅可以识别蛋白种类还可以量化构成变化。胞内蛋白质组丰度的动态变化对各种生命过程有重要影响。例如在许多疾病的发生和发展进程中，常常伴随着某些蛋白质的表达异常。目前定量蛋白质组学技术主要分为标记(label)策略和非标记的(label free)定量策略，其中标记策略又分为体内标记(如SILAC、15N标记)，以及体外标记(如iTRAQ、TMT标记)。传统的基于2D双向凝胶电泳分离的蛋白质组通常可以鉴定出约1000种蛋白，对全蛋白质组的覆盖仅在5~10%左右，远远不能满足高通量定量蛋白质表达谱分析的要求。定量蛋白质组学服务结合精细的样品制备与超高分辨率、高灵敏度的液相色谱-质谱联用技术，可在细胞与组织类样品中鉴定直至超过10000个蛋白，对全蛋白质组的覆盖>60%。结合生物信息学分析，可以为客户构建高通量蛋白质定量表达谱。应用[6][7][8]1.生物医学应用定量蛋白质组学在医学领域具有独特的应用，特别是在药物和生物标志物发现领域。定量蛋白质组学可以标记不同蛋白质的复杂性质和定量分析，比更多传统方法（蛋白质印迹和ELISA）对蛋白质结构的差异以及翻译后修饰更敏感，因此可以量化对蛋白质的不同修饰。2.药物发现定量蛋白质组学在蛋白质靶标鉴定，蛋白质靶标验证和药物发现的毒性分析中具有重大作用。新药物的发现可被用于研究蛋白质-蛋白质相互作用，以及药物-小分子相互作用。因此，定量蛋白质组学在监测小药物样分子的副作用和理解一种药物靶标相对于另一种药物靶点的功效和治疗效果方面显示出巨大的作用。药物发现中绝对蛋白质定量的方法是LC-MS/MS和多反应监测（MRM）。3.单细胞蛋白质组学传统的质谱蛋白质组学已应用于数百万个细胞组成的大量样品。然而，这种群体平均测量对于异质样品（即人体组织或癌症）中单个细胞之间差异检测依然存在许都问题。SCoPE-MS可以量化单个哺乳动物细胞中的一千多种蛋白质，进一步的技术发展和想法可以显着提高单细胞蛋白质组学的灵敏度和通量。参考文献[1] Ong SE,Mann M(October 2005)."Mass spectrometry-based proteomics turns quantitative".Nature Chemical Biology.1(5):252–62.[2] Bantscheff M,Schirle M,Sweetman G,Rick J,Kuster B(October 2007)."Quantitative mass spectrometry in proteomics:a critical review".Analytical and Bioanalytical Chemistry.389(4):1017–31.[3] Nikolov M,Schmidt C,Urlaub H(2012).Quantitative mass spectrometry-based proteomics:an overview.Methods in Molecular Biology.893.pp.85–100.[4] Bantscheff M,Lemeer S,Savitski MM,Kuster B(September 2012)."Quantitative mass spectrometry in proteomics:critical review update from 2007 to the present".Analytical and Bioanalytical Chemistry.404(4):939–65.[5] "Quantitative targeted absolute proteomics-based ADME research as a new path to drug discovery and development:methodology,advantages,strategy,and prospects".Journal of Pharmaceutical Sciences.100(9):3547–59.[6] Rix U,Superti-Furga G(September 2009)."Target profiling of small molecules by chemical proteomics".Nature Chemical Biology.5(9):616–24.[7] Schenone M,Daník V,Wagner BK,Clemons PA(April 2013)."Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery".Nature Chemical Biology.9(4):232–40.[8] Budnik,Bogdan;Levy,Ezra;Slavov,Nikolai(2017-03-15)."Mass-spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity ring cell differentiation".bioRxiv 102681.

01 翻译后修饰蛋白质组学的研究蛋白质的翻译后修饰与其功能密切相关，细胞内已知的蛋白质翻译后修饰类型包括丝氨酸/ 苏氨酸及酪氨酸的磷酸化，赖氨酸的乙酰化、泛素化等。目前已有报道的翻译后修饰类型已超过400种。翻译后修饰是细胞精细调节生理活动的关键环节之一，如生物体内的信号通路的激活大部分与磷酸化修饰相关，蛋白质的降解功能大部分与泛素化修饰相关，细胞核内功能的调节与组蛋白的修饰密切相关。越来越多的研究表明，蛋白质翻译后修饰水平的异常与某些疾病的发生发展密切相关，如以磷酸化和糖基化为主的Tau蛋白异常翻译后修饰与阿尔茨海默病密切相关。生物质谱是蛋白质组学研究的核心技术平台，在蛋白质的鉴定、新修饰的发现和验证方面具有不可替代的作用。蛋白质的某一氨基酸位点发生翻译后修饰，则该位点上存在一个质量位移，这个质量位移可以在一级谱图和二级谱图上得以体现。例如，蛋白质的某个赖氨酸上发生乙酰化修饰，会导致此位赖氨酸增加42 Da的质量位移。通过对质谱数据的解析，可以对修饰类型及修饰发生的位点进行鉴定，因此生物质谱技术可以给蛋白质新修饰类型的发现和验证提供最为直接可靠的证据。组蛋白修饰参与调控许多重要的细胞生物学过程，如激活或抑制基因转录、DNA修复等表观遗传学现象，并与组织器官发育，细胞的发育、分化和正常功能等生理现象密切相关。研究发现，组蛋白修饰调控的异常与包括肿瘤、神经退行性、自身免疫在内的许多疾病的发生发展有密切关系。正由于组蛋白修饰在许多生理和病理过程中所起的关键作用，组蛋白修饰生物学的研究一直是过去20年来生物医学研究的热点。赖氨酸巴豆酰化和酪氨酸羟基化，并证明了赖氨酸巴豆酰化与基因活化密切相关，而且与减数分裂后期小鼠精子细胞的活性基因密切相关，提示该修饰可能是与精子发育密切相关的新型表观遗传调控因子。在众多赖氨酸修饰类型中，赖氨酸甲基化修饰对细胞染色质功能调控至关重要，甲基化修饰调控酶也是目前重要的药物靶标。然而由于技术局限，非组蛋白赖氨酸单甲基化修饰底物的富集和系统鉴定是目前的研究难点，极大地限制了赖氨酸甲基化修饰生物学功能的研究。02蛋白质组学在药物研究领域的应用近年来，随着蛋白质组学技术的飞速发展，该技术还被应用于药物的研究领域。尤其在药物的靶标蛋白确认、药物作用机制、寻找病变的基因等研究中发挥了极大的优势 ；在药物的治疗过程中，还可以应用蛋白质组学进行药物疗效的评估，明显提高了药物发现的效率。目前药物研发的策略主要有两类 ：基于靶标的药物研发和基于表型改变的药物发现。两者的区别在于 ：基于表型改变的药物发现是在已知表型改变和疗效的前提下，探索该活性化合物引起的生理生化表现及引起该表现的靶标蛋白 ；而基于靶标的药物研发则是在已知靶标蛋白生物学功能的前提下，在化合物库中筛选能够与该靶标蛋白发生相互作用并改变其生物活性的先导化合物。这两种策略的目的均在于发现活性化合物及其靶标蛋白，并在此基础上对活性化合物进行结构改造优化，并进行构效关系、药理学、毒理学等相关临床前研究。在这两种药物研究策略中，蛋白质组学都发挥着不可替代的作用。目前蛋白质组学已可以在一天的质谱采集时间内，在单个细胞克隆中鉴定出8000～10 000个蛋白质，因此蛋白质组学技术在靶标的鉴定方面具有高效、高准确性的优势。通过比较加“药”组和对照组在全蛋白质表达水平上的差异，并对这些差异蛋白质进行生物信息学分析，可以发现该“药”对细胞生理功能的影响，从而有助于加深对该“药”的用途及作用机制的认识。同时，在寻找药物靶点方面，蛋白质组学可以通过竞争性实验有效地将与药物相互作用的蛋白质富集，通过质谱分析鉴定找到目标靶蛋白，目前这是传统生物学手段所无法实现的。蛋白质组学不仅可以对药物靶标进行鉴定，还可以进一步探索药物与靶标的相互作用对蛋白质–蛋白质相互作用的影响。03展望生物医学研究经历了从20世纪初出现的生理学到20世纪中期分子生物学到21世纪初系统生物学的学科发展历程。这3个研究领域又具有各自方向的特点和限制。生理学主要集中于研究器官组织的功能和代谢作用，但缺乏对细胞内成分的鉴定和区分 ；分子生物学则主要集中于对生物体内成分的鉴定和功能研究，但缺点是研究的不同分子之间的关联性和相互作用性偏少 ；而系统生物学主要集中于对多学科研究领域的整合分析，但是受限于数据的质量和可信度等。因此3个学科的交流可在很大程度上相互促进和补充，有效地加速生命科学的研究，这也是今后生命科学的发展方向。此外，除了基因组、蛋白质组，生命科学领域也在进行着其他组学的研究，包括转录组学、代谢组学等，统称为泛组学（panomics）。越来越多的生命科学实验数据的提供，以及计算机技术的迅猛发展，这一系列的成果都预示着生命科学大数据时代的到来。大数据时代的生命科学研究，不仅在实验数据方面呈现出数量级的快速增长，且数据的复杂性也急剧增加，庞大的生物信息学平台也为大数据的整理分析提供了超高的速度和效率。处于大数据时代的蛋白质组学研究，不仅可以吸取和效仿其他组学的研究手段，同时也可以和其他大数据进行整合分析，从而挖掘出潜在的更有意义的信息，因此这是蛋白质组学的发展机遇 ；同时如果蛋白质组学不能进一步提高和合理地同其他大数据整合，那么也会很容易淹没在大数据的海洋中，因此大数据时代对于蛋白质组学来说也是一大挑战。随着精准医疗（precision medicine）时代的到来，蛋白质组学将成为寻找疾病分子标志物和药物靶标最有效的方法之一，可以让人们突破过去研究的束缚，以全新的、更精确、更完善的视角去认识疾病的发生和发展，精确寻找疾病原因和治疗靶点，最终实现个性化精准诊疗的目的。在对癌症、早老性痴呆、糖尿病等人类重大疾病的临床诊断和治疗方面，蛋白质组学技术具有十分广阔的应用前景，同时也可为相关疾病的早期诊断、药物靶标的发现、治疗和预后提供重要基础。但蛋白质组学要大规模应用于临床治疗研究，还有很长的路要走。蛋白质组的信息只有渗透到具体的生物学问题中才能发挥其优势，为了能够充分了解蛋白质在人体内的功能和作用，必须要充分了解人体内蛋白质的亚型和修饰的功能，而且蛋白质在体内发挥作用还可通过蛋白质复合体和蛋白质相互作用网络来实现，所以高通量、高效地研究人体内蛋白质复合体和蛋白质相互作用网络是蛋白质组学的一个更高的阶段。因此，从一定意义上讲，蛋白质组学的研究是“无止境”的。

国际学术期刊《自然》最新发表一篇药物研究论文称，研究人员经过分析，鉴定出参与新冠病毒(SARS-CoV-2)感染人体的332种蛋白质相互作用，其中约五分之一是已有药物的靶标，或可用于开发针对新冠肺炎(COVID-19)的疗法。为解决新冠病毒如何“劫持”人类宿主这一不甚明确的问题，该研究论文通讯作者、美国加州大学圣地亚哥分校Nevan Krogan及同事，通过调查29种新冠病毒蛋白质中的26种如何与人体蛋白质相互作用，最后鉴定出332种明显的相互作用，其中66种相互作用的人体蛋白质已经是69种已知化合物的靶标，包括29种美国食品药品监督管理局(FDA)批准的药物和40种处于临床或临床前试验中的化合物。研究团队进而对这69种化合物的一个子集进行测试，发现有两组在实验室实验中展现出抗病毒作用，这些抗病毒剂或是阻断了蛋白质翻译——病毒复制的一个关键过程，或是靶向特异性受体(Sigma1或Sigma2)，破坏病毒。这些发现表明，目前已获批或处于研究中的针对其他疾病的药物，或许可以用于开发针对新冠肺炎的疗法。论文作者提醒，该研究未在感染新冠病毒的个体身上进行测试。研究团队表示，了解新冠病毒感染人类的机制，识别可药性靶标，有望指导新冠肺炎疗法的开发。但他们也特别强调，在考虑再利用已知药物时应保持小心谨慎，因为可能存在意外的副作用。因此，后续还需要对已知会靶向新冠病毒感染相关蛋白质的药剂开展进一步研究。参考文献：Gordon, D.E., Jang, G.M., Bouhaddou, M. et al.A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2286-9

前言定量磷酸化蛋白质组学已经改变了细胞信号传导的研究，但将其应用于高通量分析仍具有挑战性。本篇由哥本哈根大学健康与医学科学院蛋白研究中心Jesper V. Olsen团队在Nature communications杂志（IF=11.878）发表题为“Rapid and site-specific deep phosphoproteome profiling by data-independent acquisition without the need for spectral libraries”的研究论文，该研究优化了DIA磷酸化蛋白质组学数据分析流程，并系统分析了激酶抑制剂对磷酸化蛋白质组的作用。标题：通过不需要谱图数据库DIA技术快速深层次剖析磷酸化蛋白质组学材料：人类上皮宫颈癌HeLa细胞、人类视网膜色素上皮RPE1细胞、酵母细胞、合成磷酸肽期刊：Nature communications影响因子：11.878发表时间：2019年12月运用生物技术：DIA磷酸化蛋白质组学技术、LC-MS/MS研究背景位点特异性蛋白磷酸化是最重要的翻译后修饰之一，失调的磷酸信号是癌症和许多其他疾病的标志。然而，大多数磷酸化蛋白质组学研究通常需要通过LC-MS / MS进行数天甚至数周的测量，分析少数具有足够深度的细胞条件，来鉴定功能性磷酸化位点。而且，当前系统可重复性地分析大量样品中的磷酸化位点仍具有挑战性，这限制了如药物筛选在内的大样本磷酸化的高通量应用。为了解决这些问题，作者开发了一种优化的非标磷酸化蛋白质组学方法，该方法结合了LC-MS / MS与DIA。这种方法能够系统地、可重复地分析数百个样品中的10,000多个磷酸化位点。此外，作者开发并采用算法来准确定位DIA数据集中的磷酸化位点，确定其在系统范围内的化学计量分数，运用此技术来确定表皮生长因子信号通路的十种主要蛋白激酶的磷酸化位点目标。研究思路研究结果1.比较DDA和DIA定量磷酸化蛋白质组学为了进行高通量磷酸化蛋白质组学研究，必须减少输入蛋白的量，提高工作流程的可重复性，并减少质谱仪的使用时间。因此，基于高通量磁性Ti-IMAC磁珠从200μg起始胰蛋白酶肽材料中富集的磷酸肽，优化了可扩展的单次分析工作流程，使用Q Exactive HF-X质谱仪上的快速28 Hz高能碰撞解离（HCD）扫描方法在15分钟的LC-MS / MS分析时间内例行定量7000个磷酸肽，总体识别率超过50％。图1 | DDA和DIA磷酸化蛋白质组学鉴定和定量a、磷酸蛋白质组学实验工作流程；b、DDA和DIA定量磷酸肽比较；c、d两个DDA/DIA重复之间的磷酸肽重叠；e、f DDA/DIA重复之间的相关性；g、用DDA和DIA在MS2扫描中在轨道阱中测量的离子；h、在轨道阱中测得的DDA和DIA离子的定量差异；i、实验工作流程；此外，作者通过调整参数设置优化了仪器设置从而获得最佳DIA性能，将均方误差（MSE）计算作为每种方法的正偏差和方差之和，分别代表准确性和精度上的定量误差，以更好地评估定量精度，使用SAM检验的显著性d得分来计算DIA 的正阳性率（TPR）和假阳性率（FPR），以测试DIA的准确和精确量化是否可以更好地识别。2. DIA特异的磷酸化位点定位算法作者使用标准DDA数据中不可用的信息开发了一种PTM本地化算法，用于以肽段为中心的分析。这包括碎片离子的完整同位素图谱，以及生成与目标前体峰形相关的短洗脱色谱图的可能性。后者允许系统地去除DDA中无法解决的任何干扰碎片离子。将这两个方面与基于碎片离子强度和质量准确度的其他评分组合成每个片段的特定加权评分，然后将其用于计算特定的位点定位评分。3.生物环境中DDA和DIA的技术比较接下来，作者评估了DIA中局部磷酸肽相对于DDA的增加覆盖是否在细胞信号研究中转化为优势，使用经不同MEK激酶抑制剂处理的EGF刺激的视网膜色素上皮细胞（RPE1）作为模型系统，并通过DDA和DIA用15分钟的梯度进行分析。图2 | 在生物环境中DDA和不同类型DIA的技术比较a、实验的工作流程；b、不同方法对于鉴定的磷酸肽、局部磷酸位点和ANOVA调节位点的概述；c、DDA；d、DIA磷酸化位点的无监督聚类分析的热图；e、motif分析；4.分数磷酸化位点化学计量分析除了对磷酸化位点进行相对定量之外，确定其占有率或绝对化学计量也很有价值。高分数化学计量学与动态调节相结合是该位点在研究的细胞环境中起作用的有力证据。有可能通过使用在这两个磷酸肽，其非磷酸化的对应肽和从SILAC数据处理条件之间的相应的蛋白观察到的比例，以确定大规模磷酸化位点的分数化学计量和TMT-复用数据。图3 | 控制比例实验工作流程5.使用激酶抑制剂的大规模磷酸化蛋白质组学为了证明此处开发的基于DIA的快速位点特异性磷酸蛋白质组学工作流程的强大功能和可扩展性，作者使用30种激酶抑制剂将其应用于表皮生长因子信号通路中的十种主要蛋白激酶的磷酸化位点靶标。图4 | 激酶抑制剂筛选a、激酶抑制剂实验概述；b、测量值平均站点强度的分层聚类；c、Fisher精确测试过高表达的激酶基序；d、已知底物和单个激酶的聚类分析；研究结论本文作者基于DIA优化了磷酸化蛋白质组学工作流程，用一种快速且可重复的方法，独立获取（DIA）分析数百个磷酸化蛋白质组。与目前先进的基于数据依赖采集（DDA）的磷酸化蛋白组学相比，基于DIA的磷酸化蛋白组学具有更宽的动态范围、更高的鉴定重复性和更高的定量灵敏度和准确性。并开发了PTM本地化算法作为DIA计算的一部分，以此作为磷酸化蛋白质组学的基准。通过分析合成磷酸肽，显示了基于DIA的磷酸化蛋白质组的特异性和高质量。此外，使用基于DIA的无标记定量技术系统分析了激酶抑制剂对磷酸化蛋白质组的作用。小鹿推荐本文优化并简化了DIA磷酸化蛋白质组学数据分析流程，提供了很多仪器设置参数以供借鉴，开发了PTM本地化算法，对我们DIA磷酸化技术改进很有帮助。文末看点文中对DIA磷酸化蛋白质组学数据分析了激酶抑制剂对磷酸化蛋白质组的作用。针对DIA磷酸化蛋白组学技术，鹿明生物建立了完善的实验流程，更推出相关活动满24个样本，为您立省18000详情请戳打破WB&ELISA的局限? 不用抗体也能做WB? 目标蛋白定量分析的新宠。

前言特拉维夫大学Tamar Geiger（Tamar Geiger课题组一直致力于使用高精度质谱的方法鉴定肿瘤治疗的潜在靶点）教授团队和Sheba医疗中心的Gal Markel团队合作在Cell发表的题为“Proteomics of Melanoma Response to Immunotherapy Reveals Mitochondrial Dependence”的研究成果，通过蛋白质组学技术和功能验证，发现了黑色素瘤细胞的代谢状态通过抗原呈递机制的内在变化和肿瘤微环境的外在变化影响了T细胞杀伤，揭示了黑色素瘤代谢状态与免疫治疗响应之间的关联，这可能有助于将来改善免疫治疗响应。中文标题：黑色素瘤对免疫治疗响应的蛋白质组学研究揭示线粒体依赖性研究对象：黑色素瘤发表期刊：Cell影响因子：38.637运用生物技术：蛋白质组学研究背景免疫疗法彻底改变了转移性黑色素瘤患者的治疗方法，极大地提高了患者的生存率。迄今为止，这种成功很大程度上归因于黑色素瘤的高突变负荷。目前，免疫检查点抑制剂（ICIs）被认为是黑色素瘤免疫治疗的主要手段，尤其是针对CTLA-4或PD1免疫检查点的抗体，但约有50％患者对治疗无反应。肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的过继细胞疗法（ACT）是一种不同的免疫治疗策略，在黑色素瘤治疗中显示出很高的疗效。当前人们已投入大量精力来确定预测性反应指标和揭示耐药机制，但主要是使用组织学、基因组学和转录组学方法，尚还缺少对黑色素瘤进行深入的蛋白质组学分析。研究思路研究结果1.黑色素瘤对TIL和抗PD1响应的蛋白质组学分析为了鉴定与免疫治疗响应相关的蛋白质网络，作者收集了116个IV期黑色素瘤样本，包括42例接受TIL治疗的患者和74例接受抗PD1治疗的患者，并进行了蛋白质组分析。作者将每个队列分为响应组（包括部分响应者和完全响应者；n = 61）和无响应组（进行性疾病；n = 48）。PD1队列包括其他疾病稳定的患者（n = 7）（图1A）。对患者临床参数的检查表明，响应者和无响应者在总体生存率上存在显著差异（图1B）。年龄和BRAF突变状态在两组之间均无显著差异。此外，先前的靶向治疗（n = 16）或抗CTLA-4（n = 29）治疗均未显示出与响应相关。在TIL队列中发现性别之间存在显著相关性，并且在响应者中血浆LDH水平低于两个队列中的非响应者（p值<0.005；卡方检验）。对于蛋白质组学分析，作者解剖了>80％肿瘤细胞的黑色素瘤区域。为了获得准确的蛋白质组定量，作者设计了一种super-SILAC混合物，该混合物由5种SILAC标记的黑色素瘤细胞系组成，可作为标准化的参考。然后将混合物以1：1的蛋白质比例掺入每个黑色素瘤样品中，以用作定量参考。混合的蛋白裂解液经酶切和分馏后，用Q-Exactive Plus或HF质谱仪进行检测（图1C）。结果共定量到10,376种蛋白质，响应者和非响应者之间的覆盖范围没有明显差异（图1D-1E）。进一步过滤保留至少70％的样品中鉴定出的蛋白质，这些蛋白中包括800多种与信号转导相关的蛋白以及数十种受体和转录因子相关的蛋白，表明它们足以覆盖细胞内过程的分析。图1 | 黑色素瘤对免疫治疗响应的蛋白质组学2.免疫疗法响应者和无响应者的功能分析作者通过Student t检验在TIL治疗和抗PD1治疗人群中分别鉴定了414和636个响应者和无响应者间的差异表达蛋白。通路Proteomaps基于KEGG注释对两组差异蛋白进行聚类，发现两种治疗方法的图谱有惊人的相似之处（图2A）。在这两种治疗方法下，响应组均以较高水平的代谢蛋白为主，而非响应组则为剪接体和RNA代谢相关蛋白为主。除代谢类别外，两种治疗方法的响应组均具有更高比例的抗原呈递以及信号传导相关蛋白。与两种疗法之间的通路高度相似性相一致，二维注释富集分析结果表明两种疗法富集类别有着高相关性（R = 0.76）。在这两种治疗中，响应组的线粒体代谢通路都显著富集（图2B）。鉴于两种疗法的响应组谱图在功能上相似，作者使用所有116例样本的数据集，进行了WGCNA分析。结果中得到了一组与患者无进展生存期，完全或部分响应以及血浆LDH水平呈正相关的模块。与之前的结果一致，这些模块富集到了抗原呈递，IFNG信号以及线粒体代谢通路（图2C）。总而言之，这些分析强调了线粒体代谢的差异通常与免疫治疗反应相关。图2 | 免疫疗法响应者和无响应者间的功能差异3.鉴定免疫治疗响应的蛋白质标志物为了鉴定与响应有关的特征蛋白，作者使用基于SVM的分类方法（基于ANOVA的特征排序），在TIL治疗队列筛选出8个特征蛋白，其中6个在响应组中上调，2个下调（图3A）。在抗PD1治疗队列中筛选出15种特征蛋白，所有特征蛋白均在响应组上调（图3B）。两组特征蛋白没有重叠，TIL治疗队列包括与脂肪酸和酮体代谢有关的蛋白质，抗PD1治疗特征蛋白由多种抗原呈递相关蛋白组成。统计分析表明抗PD1队列的15种特征蛋白质中，有12种具有统计学意义（图3C）。总体而言，作者在抗PD1治疗队列中发现了95种显著变化的蛋白质，其中83种在响应组中上调。由于TIL队列较小，因此没有显著变化的蛋白质。为了提高分析的统计能力，作者合并了两个队列，发现响应者和非响应者之间有160种显著变化的蛋白质（图3D）。图3 | 响应于免疫治疗的特征蛋白构建响应蛋白的相互作用网络得到两个高度连接的蛋白簇。第一个蛋白簇富集了IFN，抗原加工和呈递机制蛋白。第二个蛋白簇富集了参与脂质代谢和TCA循环的线粒体代谢酶（图4A–4C）。因此，尽管蛋白不一定在两种治疗情况下都能预测反应，但线粒体-IFN网络与两种治疗都相关。TIL队列中六个上调的特征蛋白在抗PD1队列中也上调（图4D）。类似地，抗PD1队列的15种特征蛋白中的10种在TIL队列中也显示出相似的趋势。重要的是，TIL响应组中MHC相关蛋白和抗原呈递机制蛋白均高于无响应组（图4E）。接下来，作者分析了特征蛋白与无进展生存期（PFS）的关系。Kaplan Meier分析显示在TIL队列中，ACAT1，SUPV3L1和HTATIP2的高表达与更长的PFS正相关（图4F）。在抗PD1队列中，大多数特征蛋白与更长的PFS显著相关。对每个特征蛋白在另一个队列中的分析表明，它们几乎与存活率无关（图4F）。图4 | 免疫治疗响应的综合分析蛋白质组学结果将黑色素瘤的代谢状态与抗原呈递和IFN信号传导相关联。鉴于这些分析可能已平均了来自不同细胞群体的信号，作者通过连续切片的免疫组化检查了关键特征蛋白在组织水平上的空间表达。免疫组化结果与蛋白质组学数据一致，这些蛋白在响应组和非响应组间的表达有着显著差异，并且这些蛋白是在黑色素瘤细胞中特异性染色（图5A和5B）。线粒体标志物和电子传输链（ETC）组分SDHA的染色在响应组的线粒体中显著增加（图5C）。作者接着检查了代谢蛋白表达与T细胞浸润之间的关联（图5C和5D）。与这些患者中更高的疗效相一致，作者发现CD8或CD3 T细胞染色与特征蛋白ACOT1，ACAT1和HADHA之间具有高度相关性（图5C）。总而言之，这些结果证明肿瘤线粒体代谢与细胞免疫原性之间存在明确的联系，这值得进行下游功能研究。图5 | 代谢蛋白和T细胞浸润的组织水平验证4. 黑色素瘤细胞免疫原性代谢调控的功能验证除了代谢特征和免疫响应之间的相关性之外，作者考虑线粒体代谢是否在增加肿瘤免疫原性方面具有功能性作用。为了诱导增加培养细胞的线粒体呼吸，作者用丙酮酸脱氢酶激酶的抑制剂二氯乙酸（DCA）处理了四种黑色素瘤细胞系，这增加了进入线粒体的碳通量。经DCA处理的细胞蛋白质组学分析显示，涉及抗原呈递的多种蛋白质表达增加（图6A）。在MHC I类蛋白中，大多数DCA处理后的黑色素瘤细胞系中HLA-A表达略有降低，而HLA-B和HLA-C显著升高，并且主要的抗原呈递因子TAP1，TAP2和B2M在不同的细胞系中显示出不同的行为。根据蛋白质组学结果，作者发现DCA处理可增加细胞表面HLA的表达，并增加mRNA表达水平（图6B-6D）。这些结果表明代谢状态不仅与治疗的响应相关，而且在增加总体抗原呈递方面具有调节作用。为了直接在特征蛋白和抗原呈递之间建立联系，作者使用了CRISPR-Cas9系统在WM266-4和Mel526黑色素瘤细胞系中敲除了两个TIL特征基因ACAT1和HADHA。此外，在同种细胞中敲除了脂肪酸氧化的主要调节剂CPT1A。蛋白质组学分析显示，与敲除细胞相比，对照组中的抗原呈递和IFN信号以及氧化磷酸化和电子传递链过程显著富集（图6E）。对基因扰动的下游影响的研究表明，在Mel526细胞中敲除ACAT1，HADHA或CPT1A后，MHC I类强度降低，HLA II类呈递细胞百分比降低（图6F，6G）。蛋白质组学分析进一步验证了这些结果，并显示了其他关键抗原呈递机制蛋白在两组间具有更高的比值（图6H）。这些结果表明，即使是TIL特征蛋白中的单个线粒体蛋白也可以影响抗原呈递机制和MHC I类表达。图6 | 抗原呈递的代谢控制代谢对抗原呈递的作用说明这些可能影响T细胞识别和肿瘤细胞杀伤。为了检验这一假设，作者将敲除组或对照组黑色素瘤细胞与匹配的T细胞共培养，并通过LDH分泌监测细胞死亡。与抗原呈递机制蛋白下调相一致，在ACAT1，HADHA和CPT1A敲除后，特异性T细胞的杀伤力明显降低（图7A）。为了通过体内小鼠模型检查这些效应，作者敲除了小鼠黑色素瘤细胞系YUMMER1.7中的Acat1，并监测其对免疫活性小鼠的肿瘤生长和免疫浸润的影响。结果表明敲除Acat1后肿瘤生长显著增加（图7B）。基于体外观察结果，作者假设敲除Acat1减少了T细胞识别，从而促进了肿瘤的进展。实际上，敲除Acat1的肿瘤细胞在RNA和蛋白质水平上均显示MHC I类和PD1配体（Pdl1）表达的显著降低（图7C–7F）。此外，与IFNG一起孵育24小时后，敲除细胞显示出对MHC I类，Pdl1和B2m的诱导作用降低（图7G）。免疫细胞谱分析显示，与对照相比，敲除Acat1的肿瘤中细胞因子产生的T细胞（cytokine-procing T cells）水平较低（图7H和7I），而浸润CD4 +和CD8 + T细胞的总百分比没有变化（图7I-7L）。此外，敲除Acat1的肿瘤中单核细胞髓样细胞（monocytic myeloid cells）的比例显著低于对照（图7M），而巨噬细胞的比例显著上升（图7N）。总的来说，这些结果说明了这些蛋白质作为影响黑色素瘤和免疫细胞调节剂的重要性。图7 | CRISPR敲除对肿瘤免疫原性和T细胞活性的影响研究结论免疫疗法彻底改变了癌症的治疗方法，但是大多数患者没有响应。本文通过蛋白质组学研究来自肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）治疗或抗PD1免疫治疗的晚期黑色素瘤患者的临床样品。统计分析表明在两种治疗中，响应组的氧化磷酸化和脂质代谢均高于非响应组。为了阐明代谢状态对免疫响应的影响，作者在代谢扰动或CRISPR-Cas9敲除后检查了黑色素瘤细胞。这些实验结果表明脂质代谢是通过提高抗原呈递而增加黑素瘤免疫原性，从而增加了对T细胞杀伤的敏感性。总的来说，蛋白质组学分析揭示了黑色素瘤代谢状态与免疫治疗响应之间的关联，这可能有助于将来改善治疗响应。小鹿推荐本文作者通过对两种免疫疗法患者组织样本的蛋白质组学分析，提出黑色素瘤细胞的代谢状态通过抗原呈递机制的内在变化和肿瘤微环境的外在变化来影响T细胞杀伤。这些结果为复杂的免疫代谢网络增加了新的认知，这可能具有重要的治疗意义。蛋白质组学在肿瘤研究领域进展迅猛，已有多种肿瘤的研究成果发表于顶级学术期刊。本文也又一次证明了蛋白质组学在生命科研领域研究中的重要作用。鹿明生物上海鹿明生物科技有限公司，一直专注于生命科学和生命技术领域，是国内早期开展以蛋白组和代谢组为基础的多层组学整合实验与分析的团队。经过近数年的发展沉淀，公司建立起了iTRAQ/TMT、4D-DIA、4D-PRM、修饰蛋白组学等蛋白组学技术平台,同时为加强学术交流，鹿明生物公众号也会一直为各位老师分享更多科研干货，欢迎关注鹿明生物官微哦~~猜你还想看◆蛋白质组学前处理方法大揭秘！学会了这几招之后“包治百病”~◆盘点 | 医学方向2020年度最佳项目文章TOP5，总影响因子：61.414◆跨年项目文章 | 两篇连发~转录组+蛋白组学对水生生物中纳米塑料毒性机理研究◆项目文章 | iTRAQ定量蛋白组学助力南京农大茶树抗寒机制研究END文章来源于鹿明生物

前言阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种以进行性记忆力减退、认知功能下降和人格改变为主要临床表现的中枢神经系统退行性疾病，是老龄人口中发病率最高的疾病之一。2020年4月13日， 美国埃默里大学Allan I. Levey教授及其合作团队再次在国际专业学术期刊《Nature Medicine》(IF =30.641)发表了最新研究成果，报道了迄今为止最大的阿兹海默症相关蛋白质组学研究。研究人员运用定量蛋白质组学技术、加权共表达网络分析、靶向蛋白质组技术（PRM）对健康人和阿兹海默症患者的2,000多个人脑组织样本和近400个脑脊液样本进行系统分析，研究确定了反映大脑生物过程的关键蛋白质共表达网络，为阿尔兹海默症的临床诊治提供了新的治疗靶标和生物标志物。标题：Large-scale proteomic analysis of Alzheimer’s disease brain and cerebrospinal fluid reveals early changes in energy metabolism associated with microglia and astrocyte activation研究对象：认知健康、正常衰老的个体、AD患者的脑组织和脑脊液期刊：Nature Medicine影响因子：30.641发表时间：2020年4月13日研究背景阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease, AD）以β-淀粉样蛋白（amyloid-β, Aβ）过度沉积和Tau蛋白异常磷酸化为主要发病机理的神经变性疾病。然而对于AD病理生理学机制还不完全了解。研究思路文章亮点1、样本珍贵：尸检脑组织样本；2、大样本量：约2000个组织样本和400个脑脊液样本；3、多种技术：LFQ、TMT定量蛋白质组学、PRM和SRM蛋白验证等；4、多个中心：至少7个采样中心，BLSA，Banner，MSSB，ACT，Mayo，ROS/MAP，UPenn等；5、多种组织类型：3种组织样本：FLPFC背外侧前额叶皮质、temporal cortex颞叶皮质、precuneus楔前叶，以及脑脊液CSF；6、多种疾病类型：主要是AD的，还检测了其他神经退行性疾病，比如：肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶变性伴TDP-43病理(FTLD-TDP)、进行性核上性瘫痪(PSP)、皮质基底部变性(CBD)、帕金森病和帕金森病痴呆(PD/PDD)和多系统萎缩(MSA)等。寻找AD致病最相关、以及最特异的区域/细胞/蛋白；7、采用WGCNA分析，将几千个蛋白与临床相关指标进行关联分析，得到不同功能的蛋白模块集；8、将大脑中不同细胞类型的marker基因跟不同模块集进行比对，从而形成细胞类型-蛋白模块-功能这样的关联集。（类似于单细胞测序的将marker基因跟细胞亚类和功能与疾病做关联）；9、实验设计逻辑严密、故事性强。研究内容本研究使用定量蛋白质组和加权共表达网络分析对AD进行了迄今为止最大的蛋白质组学研究。从4个研究中心收集了44例巴尔的摩衰老纵向研究（BLSA）、178例版纳太阳卫生研究所（BANNA）、166例西奈山医学院（MSSB）和65例成人思维变化研究（ACT）非北侧前额叶皮质（DLPFC）组织，总共453例对照、无症状AD (AsymAD)和AD。采用无标记定量（LFQ）对组织进行定量蛋白质组学分析，共鉴定到5688个蛋白。通过回归分析消除了年龄、性别和死后间隔（PMI）对蛋白质定量数据的影响，最终确定3334个蛋白利用加权相关网络分析算法构建蛋白共表达网络。加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-Expression Network Analysis，WGCNA）是一种适合进行多样本复杂数据分析的工具，通过计算基因/蛋白间表达关系，鉴定表达模式相似的基因/蛋白集合（mole），解析mole与样品表型之间的联系，绘制集合中基因/蛋白之间的调控网络并鉴定关键调控基因/蛋白。对鉴定到的3334个蛋白进行WGCNA共表达分析，将其分为13个模块。研究结果① 构建AD共表达网络模块为了评估这些共表达模块是否与AD相关，将模块蛋白表达水平与AD、淀粉样β斑块和神经纤维缠结的神经病理学特征相关联。观察到六个模块与所有病理、认知和功能测量显著相关：模块M1突触、模块M3线粒体、模块M4糖代谢、模块M5细胞外基质、模块M6细胞骨架和模块M10 RNA结合/剪接。M4糖代谢模块显示出最强的AD性状相关性（认知r=-0.67，P=8.5×10-23；神经纤维缠结r=0.49，P=4.7×10-27；淀粉样β斑块r=0.46，P=1.3×10-23；功能r=0.52，P=2.6×10-12）。因为大脑中许多蛋白质共表达的改变可以由细胞类型的改变驱动，因此分析了每个共表达模块是否富含在特定的细胞类型中。同时为了将每个模块的细胞类型特性纳入其描述中，随后将那些细胞类型丰富的模块称为“M1突触/神经元”模块、“M2髓鞘/少突胶质细胞”模块、“M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢”模块和“M5内皮/微细胞外基质”模块。进一步研究表明在AD临床前期的病理过程中，M3线粒体和M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块的病例状态差异最大。图1 | 无症状和有症状AD脑的蛋白质网络分析（a）用WGCNA和差异丰度对对照组和AD患者（N=453）脑组织蛋白水平分析；（b）从四个独立的队列中测量的3334个蛋白质中产生了由13个蛋白质模块组成的蛋白质相关网络。② AD network与脑区、年龄、其他神经退行性疾病的关联性分析进一步分析了这些共表达模块与不同脑区、年龄、其他神经退行性疾病的相关性，发现所有的模块都与颞叶皮层相关，12个模块与楔前叶相关。M1突触/神经元模块蛋白随着年龄增加其表达水平显著降低，M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块蛋白随着年龄增加其表达水平显著升高。在FTLD-TDP和CBD病例中，M1突触/神经元和M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块蛋白表现出显著变化。图2 | 分析AD患者年龄与网络模块蛋白的相关性（a）在不同年龄死亡的认知健康人群中测定DLPFC中的蛋白质水平，并用于分析AD蛋白质网络模块随年龄的变化；（b）为每个AD网络模块创建一个合成的特征蛋白，并按年龄组测量，以及与老化脑队列中的年龄相关。显示了模块M1、M3、M4和M10的合成特征蛋白分析。③ 采用PRM验证共表达网络模块蛋白的表达为了进一步验证上述研究发现，采用PRM蛋白验证对324个蛋白进行靶向验证，分析表明组学结果和PRM靶向验证结果具有很好的一致性。采用GWASs分析AD模块蛋白是否为AD疾病相关的风险因子，分析发现模块M2和M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块与AD疾病风险显著相关，表明这些蛋白共表达模块所反映的生物功能或过程可能在AD中起致病作用。鉴于M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块与AD有很强的相关性，对该模块进行了更深入的研究。小胶质蛋白markers通过表达上调来响应淀粉样β斑块，表达下调来发挥抗炎症作用。图3 | M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块富含AD遗传危险因素和抗炎症相关小胶质细胞标志物（a）采用GWASs分析AD模块蛋白是否为AD疾病相关的风险因子；（b）AD蛋白网络模块中星形胶质细胞（顶部）和小胶质细胞（底部）表型标记的富集；（c）模块M4中按模块特征蛋白相关值（kME）排列的前100位蛋白的互作网络分析；（d）AD小鼠模型中与M4模块中的蛋白质重叠的前30个差异最大的小胶质细胞的转录表达情况；④ M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块蛋白的表达水平在脑脊液中显著增加为探讨M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块中的蛋白质是否可以作为AD体液样本的生物标记物，作者分析了两个队列的脑脊液（CSF）样本的TMT标记定量蛋白质组学。在队列1中，观察到22个蛋白映射到M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块。其中CD44、PRDX1、DDAH2、LDHB和PKM蛋白显著差异性表达。在队列2中，27个蛋白映射到M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块。其中17个蛋白与队列1中重合，且在AD-CSF中表现出相同的表达趋势，在AsymAD患者的CD44、LDHB和PKM也出现显著或趋势性升高，并与认知功能相关。总之，M4节点蛋白CD44、PRDX1和DDAH2在AsymAD和AD患者中的表达显著升高。这些蛋白质也可能作为液体中的生物标志物，在疾病早期提示疾病存在。基于这些数据和分析，研究人员可以从中找出能够治疗和预防AD的新靶点，或是开发液体检测可用的生物标记物。图4 | M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块蛋白水平在AsymAD和AD-CSF中升高（a）两组脑脊液M4蛋白的分析方法；（b）测定相对蛋白水平；研究结论作者通过基于MS的蛋白质组学对2000多个大脑和近400个脑脊液样本的综合研究，提供了阿兹海默症的蛋白质网络变化和与疾病无症状和症状阶段相关的生物学变化，并强调了蛋白组学在疾病发病机理研究中的重要作用。针对这一生物学特性的项目有望用于阿兹海默症药物治疗和生物标记物开发，特别是针对促炎和抗炎星形胶质细胞和小胶质细胞的项目。作者简介Allan I. Levey博士，Emory University神经学系教授Allan I. Levey博士是埃默里大学(Emory University)神经学系教授和系主任，也是埃默里老年痴呆症研究中心(Emory Alzheimer 's Disease Research Center)主任。Levey博士是国际公认的神经生物学专家，在神经退行性疾病方面做出了诸多原创性工作。他发表了270多篇研究论文。他的工作有助于理解包括阿尔茨海默病和帕金森病在内的神经退行性疾病的大脑系统和机制，并为新的治疗策略确定分子靶点。他获得多个奖项,包括Derek Denny-Brown Neurological Scholar Award, Heikkila Research Scholar Award及 Health Advancement Research Award。Levey博士还被评为ISI神经科学领域的高引用研究员，并一直被列为美国最好的医生之一。参考文献Johnson ECB et al. Large-scale proteomic analysis of Alzheimer’s disease brain and cerebrospinal fluid reveals early changes in energy metabolism associated with microglia and astrocyte activation. Nature Medicine. 2020 Apr 13. doi:10.1038/s41591-020-0815-6END