蛋白质组学研究方法

蛋白互作技术蛋白质是生物功能最直接的执行者，虽然一些蛋白质可以独立的完成他的使命，但是大部分的蛋白都是需要一些伴侣分子的协助一起完成任务或者形成复合物之后才能充分发挥他的功能。所以，了解蛋白质与蛋白质之间的相互作用，能够帮助我们更好的了解细胞的生命活性，揭示隐藏在表象下的调控机理。经典的蛋白互作研究方法主要包括三个：酵母双杂交、免疫共沉淀、GST-pull down。1. 酵母双杂交技术：主要用来进行互作蛋白的筛选，缺点就是假阳性较高，所以需要进行结果验证，一般可采用免疫共沉淀或GST-pull down实验进行验证。2. 免疫共沉淀：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内相互作用的有效方法。当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。当用预先固化在argarose beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行Western blot检测，进而证明两者间的相互作用。3. GST pull-down实验：是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术。其基本原理是先构建靶蛋白-GST融合蛋白载体，然后进行体外表达及纯化。将得到的靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，充当一种“诱饵蛋白”，然后将目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的蛋白，将目的蛋白洗脱下来，通过SDS-PAGE电泳及western blot分析证实两种蛋白间的相互作用。以上三种方法是比较经典的研究筛选和验证蛋白互作关系的方法。但是也存在一定局限性。酵母双杂交可以大规模的筛选未知的互作蛋白，但是假阳性高，免疫共沉淀及pull down只是对已知的蛋白互作关系进行验证，不能发现新的未知蛋白。免疫沉淀-质谱联用IP-MS技术随着蛋白质组学技术的发展，将免疫亲和与质谱技术结合产生的IP-MS技术则逐渐显示出他的优势。原理是以细胞内源性靶蛋白为诱饵，将靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行共孵育，促进免疫复合物的形成；随后加入能够与抗体结合的protein-A/G（预先结合固化在琼脂小珠上），形成”结合蛋白-靶蛋白-靶蛋白抗体-proteinA/G小珠”复合物，纯化该复合物凝胶电泳分离蛋白，应用质谱分析鉴定靶蛋白的结合蛋白。免疫共沉淀与质谱结合，不仅能验证已知蛋白的相互作用，而且还可以鉴定与目标蛋白互作的未知蛋白，为科学研究提供全新的实验思路。北京百泰派克生物科技有限公司提供蛋白互作，GST pulldown，免疫共沉淀及IP-MS相关服务，欢迎垂询！资料来源：网络资料图片来源：百泰派克生物【biotech-pack】

011 蛋白质组学概念的提出早在18世纪，人类就发现了蛋白质这一类型的生物分子，然而直到1938年，瑞典化学家Jons Jakob Berzelius才明确提出了蛋白质的概念，指出蛋白质是由氨基酸组成的一类生物大分子。1949年，英国科学家Frederick Sanger首次测得了蛋白质牛胰岛素的氨基酸序列，并验证了蛋白质由氨基酸组成，他也凭借此项研究成果获得了1958年的诺贝尔化学奖。就在同一年，英国科学家Francis Crick首次提出分子生物学中心法则，这是20世纪生命科学领域最重要的发现之一 ：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）是生物体内遗传信息的载体，DNA以自身为复制模板，通过转录作用将遗传信息传递给核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），成熟的信使RNA（messenger RNA，mRNA）在核糖体上被翻译成一条长肽，然后经折叠加工形成具有生理活性的成熟蛋白。蛋白质是生命的物质基础，作为生物体活动功能的最终直接执行者，对生命活动的实现具有十分重要的作用，参与了生物体内几乎所有的生命活动过程。随着分子生物学技术的发展，蛋白质的诸多功能不断被研究和报道，如蛋白质可以作为离子通道参与信号转导等，人们愈发重视对蛋白质的研究。21世纪初，生命科学领域迎来了一个重要的里程碑——人类基因组草图的绘制完成。2001年由美国、英国、法国、德国、日本和中国科学家共同参与的人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）与Celera基因公司共同公布了人类基因组DNA序列草图，这也代表着人类在生命科学领域迈上了新台阶。2003年该计划的完成可以说是近半个世纪以来最激动人心的一项生命科学成就，它第一次揭示了人类的DNA序列信息，并提供了人类生命信息的蓝图。该研究成果分别发表在Nature、Science两大国际著名期刊上（Lander et al.，2001；Venter et al.，2001）。人类基因组计划因其破解人类遗传密码的里程碑式意义及对于遗传性疾病预防的潜在应用价值，与阿波罗登月计划、曼哈顿原子弹计划一起，并称为自然科学史上的三大计划。随着人类全基因组序列的破译和功能基因组学研究的展开，生命科学家越来越关注如何用基因组研究的模式开展蛋白质组学的研究。因此，Nature、Science在公布人类基因组草图的同时，分别发表了“And now for the proteome”和“Proteomics ingenomeland”的述评与展望（Abbott，2001；Fields，2001）。文中认为蛋白质组学将成为21世纪最大的战略资源，并将成为人类基因争夺战的战略制高点之一，这将蛋白质组学的地位提高到了前所未有的高度。事实上早在1994年，澳大利亚科学家Marc Wilkins便提出了蛋白质组（proteome）这一概念——表征基因组所能表达的全部蛋白。1997年，蛋白质组学（proteomics）的概念产生，其研究的主要内容是细胞、组织或器官内的全部蛋白质。此后该学科迅速发展，并得到了生命科学研究领域的重视。2001年，国际人类蛋白质组组织（Human Proteome Organization，HUPO）正式宣告成立，推动了蛋白质组学研究领域的发展。在2002年国际蛋白质组研讨会上，科学家明确提出了开展 “人类肝脏蛋白质组计划（Human Liver Proteome Project，HLPP）”的建议，并于2003年正式启动，至此人类蛋白质组计划的帷幕正式拉开。该项目也是我国科学家在生命科学领域领导的一次重大国际合作项目。蛋白质组学在细胞的增殖、分化、肿瘤形成等方面的研究中已经取得了不少成果和进展。尤其在癌症研究方面，已经鉴定到了一批肿瘤相关蛋白，这为相关疾病的早期诊断、蛋白质药物靶标的发现、治疗和预后提供了重要依据和线索。022 蛋白质组学的特点人类基因组序列的测定，标志着基因的研究迈上新台阶。随着基因测序技术的改进和成熟，人们对基因的研究更加便捷，对基因的认识也逐渐深入。目前认为可编码蛋白质的基因约20 000个。然而同一个基因可以表达出不同的信使RNA片段，而信使RNA在成熟过程中可能会出现剪切重组等，这显著增加了可表达蛋白的数目。同时，信使RNA翻译出的蛋白质会经历翻译后修饰（Berget，1995；Witze et al.，2007），实现对自身功能的调控，这进一步使蛋白质组的研究复杂化。此外，细胞内表达的蛋白质在时间和空间尺度上具有动态变化的性质，因此细胞内蛋白质的分析远比基因组的分析复杂和具有挑战性。基因组学的研究对象是DNA，DNA的性质较为稳定，且微量的目标样品可以通过PCR技术将其扩增，从而便于研究。目前DNA测序技术已较为成熟，且基因组学的数据库已相对完善，对于基因的研究已经进入了相对成熟的阶段。然而作为基因组后时代，蛋白质组目前尚处于探索和发展阶段。蛋白质组学研究的对象——蛋白质，其本身的性质不够稳定，可能同时存在多种不同的翻译后修饰类型，且其在不同细胞、组织内的表达丰度的动态范围较大。随着高分辨生物质谱技术的迅速发展及基于基因序列的蛋白质数据库的逐步完善，目前已可以实现对蛋白质氨基酸序列的测定，但是仍有大量的内容是未知的，包括蛋白质的定位、蛋白质与小分子的相互作用、蛋白质与蛋白质的相互作用、蛋白质的生命周期等。蛋白质组学的研究，可以从时间和空间角度对细胞、组织的蛋白质进行全面深入的研究，从而深入理解细胞如何利用蛋白质实现各种生理功能的调控。蛋白质组学亟待发展，研究技术也有待进一步发展和提升。033 生物质谱技术科学的进步往往带来技术的革新，而技术的革新会加速科学的发展。在蛋白质组学概念提出后的几年，由于受到研究技术的限制，发展十分缓慢。近些年，高分辨质谱技术（mass spectrometry，MS）的迅速发展，成为了蛋白质组学领域的核心技术。质谱技术是化学领域中研究化合物的一个重要手段。然而，直到软电离离子化技术的出现，才使得用质谱研究生物大分子成为了可能。2002年的诺贝尔化学奖授予美国科学家John Fenn和日本科学家Koichi Tanaka（“The Nobel Prize in Chemistry 2002”。Nobelprize.org. Nobel Media AB 2014. Web. 30 Apr 2015），以表彰他们在将软电离离子化方法用于生物大分子质谱分析方面所作出的贡献。John Fenn发明了电喷雾离子化方法（electrospray ionization，ESI）（Fenn et al.，1989）。样品在毛细管色谱柱中分离，经毛细管柱柱头流出时，在高压电场的作用下形成带电的小液滴。随着液滴的溶剂蒸发，液滴表面离子密度逐渐增大，当达到瑞利（Rayleigh）极限时，液滴发生破裂，形成更小的带电液滴。而后在电场作用下重复蒸发、分裂的过程，直至形成气相离子进入质谱，并被检测。该方法的优点在于可以实现从液态到气态分子的转变，产生的离子可以带有一个或多个电荷。Koichi Tanaka发明的基质辅助激光解析离子化技术（matrix-assisted laser desorption ionization，MALDI）利用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，从而使生物分子电离（Tanaka et al.，1988）。由于电喷雾离子化可形成单电荷离子及多电荷离子而有别于其他的MS离子化技术，并能实现高效液相与质谱的串联。特别是在1994年，Wilm和Mann发展了纳升级喷雾离子源（nano-electrospray ionization source，nanoESI source），与传统的ESI源（流速1～100 L/min）相比，该离子源可以采用更小的溶剂流速（10～500 nL/min），并且电喷雾更稳定，生成的带电液滴更小，能在室温条件下更好地实现去溶剂化（Wilm and Mann，1996），所以在目前的生物质谱中尤其是蛋白质组学研究领域，nanoESI离子化技术应用较为广泛。此外，对于质谱仪而言，质量分析器是其核心部件。随着分辨率和检测速率的提高，质谱仪在蛋白质组学研究中的优势逐渐凸显。目前已有的质量分析器的类型有 ：磁质谱、双聚焦质谱、离子回旋共振质谱、四极杆、四极杆离子阱质谱、时间飞行质谱、傅里叶变换质谱、三重四极杆质谱、线性离子阱质谱、静电轨道场离子回旋加速质谱（Orbitrap）等。其中，Orbitrap无疑是近20年质谱技术中最重要的发明。它极大地缩小了高分辨质量分析器的体积，维护更方便，使得高分辨质谱的台式化和易用化成为了可能，从而便于应用和推广。Thermo公司于2005年推出了第一台商业化的Orbitrap型质谱仪，其分辨率达到了100 000 （m/z 400），最大扫描速度为1.0 Hz。目前高效液相串联质谱在蛋白质和蛋白质的翻译后修饰的鉴定分析方面起着重要的作用，其原理是待测样品经高效液相色谱分离之后，经离子源的离子化，进入质谱。在质谱内通过特定的方式，将母离子碎裂产生碎片离子 ；进一步对碎片离子进行检测，得到该分析物的质谱检测图谱。随后对该图谱进行分析，通过与蛋白质数据库中的理论图谱比对，从而将其氨基酸序列信息和含有的修饰解析出来。质谱技术在生物大分子领域中的应用越来越广，包括定性和定量的高通量蛋白质分析，高通量的蛋白质翻译后修饰分析，鉴定蛋白质-蛋白质相互作用和调控网络，鉴定蛋白质和小分子的相互作用，生物标志物的鉴定和研究等。044 蛋白质组学的研究进展近20年来，蛋白质组学领域的研究技术在不断地革新和提高。1989年，电喷雾离子化技术发明，使得用质谱分析生物大分子成为可能；1993年，肽指纹图谱技术发明，推动了蛋白质鉴定技术的发展 ；1996年，利用二维凝胶电泳技术，实现了对酵母全蛋白的分析 ；2002年，细胞培养稳定同位素标记（stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC）技术发明，使得定量蛋白质组学研究迈上新台阶。1998年，中国启动了“人类肝脏蛋白质组计划”。2010年，中国团队完成肝脏蛋白质组的检测，共鉴定到6788个蛋白质，至此第一个人类器官的全蛋白质组检测工作得以完成（He，2005）。但由于当时的技术局限，所鉴定的蛋白质的数目还远远没有达到理论上肝脏全蛋白质组的蛋白数。近几年来，生物质谱技术进一步发展，其检测灵敏度和分辨率明显提高，扫描速度也有了显著提升，已经具备了高通量深度蛋白质组学研究的条件。因而，关于全蛋白质表达谱研究工作的报道越来越多。基于质谱的飞速发展，科研工作者目前已经对细胞内的不同细胞器做了组学研究，包括线粒体、高尔基体、细胞核等。蛋白质组学领域的知名科学家Matthias Mann在2008年报道了用一个月的时间鉴定了接近8000个蛋白质的成果（Hubner et al.，2008）。2011年，经过样品制备方法的创新、色谱分离方法的优化和质谱仪器的升级，Mann团队通过利用样品处理新方法FASP（flter-aided sample preparation）对小鼠的肝脏组织进行蛋白质组学研究，最终在21 d质谱数据采集时间内鉴定了高于10 000个蛋白质（Wisniewski et al.，2011），这是目前最具深度的蛋白质组学研究之一。随着质谱仪准确度、分辨率和扫描速度的不断提高，Mann实验室在2014年利用Q Exactive超高分辨率质谱仪，在4 d时间内定量分析了小鼠肝脏组织样本中的11 520个蛋白质（Azimifar et al.，2014）。因此随着样品制备方法、色谱分离方法及质谱仪器的不断优化和创新，科学家可以对生物体内的蛋白质进行更具深度的鉴定，从而更加深入地研究生命活动中的生理生化过程。2014年，国际著名杂志Nature子刊Nature Methods评述了近10年内的自然科学研究领域方法，基于质谱的蛋白质组学技术便是其中之一（Ten years of Methods，2014），可见质谱的发展对自然科学研究领域产生了极为重要的影响。当然，组学的研究并非仅仅是蛋白质测序，还包括了组学定量、靶向蛋白质组的研究等。其中靶向蛋白质组的研究被列入了Nature Methods 2012年度生命科学研究的方法学进展。2014年对于蛋白质组学的研究来说是具有里程碑意义的一年。4月，国际顶级期刊Nature首次报道了两篇关于接近完整的人类蛋白质组表达谱草图的文章。其中一篇文章收集了30种人类正常组织和细胞样本，包括成人和胎儿的组织及血液细胞，最终共鉴定到17 294个基因编码的蛋白，占总编码蛋白基因数的84%（Kim et al.，2014）。另外一篇文章，则综合了已发表的公共数据集及其实验室已有的数据，包括数十种人类组织、体液样本及细胞株等的鉴定分析结果，共鉴定到18 097个基因编码蛋白，占总编码蛋白基因数的92%（Wilhelm et al.，2014）。以上两篇文章共同绘制出了第一张人类蛋白质草图。近些年，中国蛋白质组学研究领域也在快速发展。2014年，“中国人蛋白质组草图计划”（CNHPP）这一科技部的重点项目正式展开，计划绘制包括心脏、肝脏、肺、肾脏等在内的10个最重要人体器官的蛋白质组生理和病理图谱，旨在以中国重大疾病的防治需求为牵引，发展蛋白质组研究相关设备及关键技术，构建中国人类蛋白质组的“百科全书”。055 蛋白质组学的应用通过基因组测序和分析，可以发现多种诱发癌症的驱动基因。2013年在Science杂志上发表了题为“Cancer genome landscape”的综述（Vogelstein et al.，2013），提出大部分癌症的发生是由于2～8个驱动基因突变，人体内目前认知到的癌症驱动基因共有约140个。尽管如此，驱动基因突变并不能解释所有癌症发生发展的现象。例如，2014年Nature杂志上发表的对230例肺腺癌临床样本的研究结果称，部分样本的基因组测序结果未能解释信号通路被激活的现象（The Cancer Genome Atlas Research Network，2014）。为了加深对癌症发生发展机制的认识，迫切需要对癌症进行深入的蛋白质组学研究，从而从蛋白质水平阐释癌症可能的发生发展机制。2006年年初，美国国立癌症研究院（National Cancer Institute，NCI）开始了一项为期5年，耗资1.04亿美元的临床蛋白质组肿瘤分析联盟（Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium，CPTAC）（Ellis et al.，2013），其目的在于建立应用于癌症诊断、治疗和预防的蛋白质组学技术，建立数据分析标准流程及试剂、参考物质的应用等系统，从而达到拓宽蛋白质组学技术在临床癌症诊断中的应用。目前该项目已经取得了非常出色的进展，其中一项工作为对被TCGA项目（The Cancer Genome Atlas）表征的95个结肠和直肠癌样本进行了深入的蛋白质组学及生物信息学分析，从蛋白质组学层面对结肠、直肠癌进行分型。在所得的5种蛋白质分型中，其中的两种与TCGA的一种转录本亚型——“微卫星不稳定亚型/CpG岛甲基化表型亚型”有重叠部分，但也发现了与之明显不同的基因突变、DNA甲基化和蛋白质表达图谱，这些都具有不同的临床表现，为临床疾病的研究提供了新的思路和检测指标（Zhang et al.，2014）。蛋白质组学在人类疾病中的研究应用已经在一些疾病中开展，如癌症、皮肤病、心脏病等。研究包括寻找与疾病相关的单个蛋白，整体研究某种疾病引起的蛋白质表达或修饰水平的变化，利用蛋白质组寻找一些致病微生物引起的疾病的诊断标记和疫苗等。随着精准医疗时代的到来，蛋白质组学在药物研究、临床诊断和个性化治疗等方面将具有更为广阔的应用前景。

前言特拉维夫大学Tamar Geiger（Tamar Geiger课题组一直致力于使用高精度质谱的方法鉴定肿瘤治疗的潜在靶点）教授团队和Sheba医疗中心的Gal Markel团队合作在Cell发表的题为“Proteomics of Melanoma Response to Immunotherapy Reveals Mitochondrial Dependence”的研究成果，通过蛋白质组学技术和功能验证，发现了黑色素瘤细胞的代谢状态通过抗原呈递机制的内在变化和肿瘤微环境的外在变化影响了T细胞杀伤，揭示了黑色素瘤代谢状态与免疫治疗响应之间的关联，这可能有助于将来改善免疫治疗响应。中文标题：黑色素瘤对免疫治疗响应的蛋白质组学研究揭示线粒体依赖性研究对象：黑色素瘤发表期刊：Cell影响因子：38.637运用生物技术：蛋白质组学研究背景免疫疗法彻底改变了转移性黑色素瘤患者的治疗方法，极大地提高了患者的生存率。迄今为止，这种成功很大程度上归因于黑色素瘤的高突变负荷。目前，免疫检查点抑制剂（ICIs）被认为是黑色素瘤免疫治疗的主要手段，尤其是针对CTLA-4或PD1免疫检查点的抗体，但约有50％患者对治疗无反应。肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的过继细胞疗法（ACT）是一种不同的免疫治疗策略，在黑色素瘤治疗中显示出很高的疗效。当前人们已投入大量精力来确定预测性反应指标和揭示耐药机制，但主要是使用组织学、基因组学和转录组学方法，尚还缺少对黑色素瘤进行深入的蛋白质组学分析。研究思路研究结果1.黑色素瘤对TIL和抗PD1响应的蛋白质组学分析为了鉴定与免疫治疗响应相关的蛋白质网络，作者收集了116个IV期黑色素瘤样本，包括42例接受TIL治疗的患者和74例接受抗PD1治疗的患者，并进行了蛋白质组分析。作者将每个队列分为响应组（包括部分响应者和完全响应者；n = 61）和无响应组（进行性疾病；n = 48）。PD1队列包括其他疾病稳定的患者（n = 7）（图1A）。对患者临床参数的检查表明，响应者和无响应者在总体生存率上存在显著差异（图1B）。年龄和BRAF突变状态在两组之间均无显著差异。此外，先前的靶向治疗（n = 16）或抗CTLA-4（n = 29）治疗均未显示出与响应相关。在TIL队列中发现性别之间存在显著相关性，并且在响应者中血浆LDH水平低于两个队列中的非响应者（p值<0.005；卡方检验）。对于蛋白质组学分析，作者解剖了>80％肿瘤细胞的黑色素瘤区域。为了获得准确的蛋白质组定量，作者设计了一种super-SILAC混合物，该混合物由5种SILAC标记的黑色素瘤细胞系组成，可作为标准化的参考。然后将混合物以1：1的蛋白质比例掺入每个黑色素瘤样品中，以用作定量参考。混合的蛋白裂解液经酶切和分馏后，用Q-Exactive Plus或HF质谱仪进行检测（图1C）。结果共定量到10,376种蛋白质，响应者和非响应者之间的覆盖范围没有明显差异（图1D-1E）。进一步过滤保留至少70％的样品中鉴定出的蛋白质，这些蛋白中包括800多种与信号转导相关的蛋白以及数十种受体和转录因子相关的蛋白，表明它们足以覆盖细胞内过程的分析。图1 | 黑色素瘤对免疫治疗响应的蛋白质组学2.免疫疗法响应者和无响应者的功能分析作者通过Student t检验在TIL治疗和抗PD1治疗人群中分别鉴定了414和636个响应者和无响应者间的差异表达蛋白。通路Proteomaps基于KEGG注释对两组差异蛋白进行聚类，发现两种治疗方法的图谱有惊人的相似之处（图2A）。在这两种治疗方法下，响应组均以较高水平的代谢蛋白为主，而非响应组则为剪接体和RNA代谢相关蛋白为主。除代谢类别外，两种治疗方法的响应组均具有更高比例的抗原呈递以及信号传导相关蛋白。与两种疗法之间的通路高度相似性相一致，二维注释富集分析结果表明两种疗法富集类别有着高相关性（R = 0.76）。在这两种治疗中，响应组的线粒体代谢通路都显著富集（图2B）。鉴于两种疗法的响应组谱图在功能上相似，作者使用所有116例样本的数据集，进行了WGCNA分析。结果中得到了一组与患者无进展生存期，完全或部分响应以及血浆LDH水平呈正相关的模块。与之前的结果一致，这些模块富集到了抗原呈递，IFNG信号以及线粒体代谢通路（图2C）。总而言之，这些分析强调了线粒体代谢的差异通常与免疫治疗反应相关。图2 | 免疫疗法响应者和无响应者间的功能差异3.鉴定免疫治疗响应的蛋白质标志物为了鉴定与响应有关的特征蛋白，作者使用基于SVM的分类方法（基于ANOVA的特征排序），在TIL治疗队列筛选出8个特征蛋白，其中6个在响应组中上调，2个下调（图3A）。在抗PD1治疗队列中筛选出15种特征蛋白，所有特征蛋白均在响应组上调（图3B）。两组特征蛋白没有重叠，TIL治疗队列包括与脂肪酸和酮体代谢有关的蛋白质，抗PD1治疗特征蛋白由多种抗原呈递相关蛋白组成。统计分析表明抗PD1队列的15种特征蛋白质中，有12种具有统计学意义（图3C）。总体而言，作者在抗PD1治疗队列中发现了95种显著变化的蛋白质，其中83种在响应组中上调。由于TIL队列较小，因此没有显著变化的蛋白质。为了提高分析的统计能力，作者合并了两个队列，发现响应者和非响应者之间有160种显著变化的蛋白质（图3D）。图3 | 响应于免疫治疗的特征蛋白构建响应蛋白的相互作用网络得到两个高度连接的蛋白簇。第一个蛋白簇富集了IFN，抗原加工和呈递机制蛋白。第二个蛋白簇富集了参与脂质代谢和TCA循环的线粒体代谢酶（图4A–4C）。因此，尽管蛋白不一定在两种治疗情况下都能预测反应，但线粒体-IFN网络与两种治疗都相关。TIL队列中六个上调的特征蛋白在抗PD1队列中也上调（图4D）。类似地，抗PD1队列的15种特征蛋白中的10种在TIL队列中也显示出相似的趋势。重要的是，TIL响应组中MHC相关蛋白和抗原呈递机制蛋白均高于无响应组（图4E）。接下来，作者分析了特征蛋白与无进展生存期（PFS）的关系。Kaplan Meier分析显示在TIL队列中，ACAT1，SUPV3L1和HTATIP2的高表达与更长的PFS正相关（图4F）。在抗PD1队列中，大多数特征蛋白与更长的PFS显著相关。对每个特征蛋白在另一个队列中的分析表明，它们几乎与存活率无关（图4F）。图4 | 免疫治疗响应的综合分析蛋白质组学结果将黑色素瘤的代谢状态与抗原呈递和IFN信号传导相关联。鉴于这些分析可能已平均了来自不同细胞群体的信号，作者通过连续切片的免疫组化检查了关键特征蛋白在组织水平上的空间表达。免疫组化结果与蛋白质组学数据一致，这些蛋白在响应组和非响应组间的表达有着显著差异，并且这些蛋白是在黑色素瘤细胞中特异性染色（图5A和5B）。线粒体标志物和电子传输链（ETC）组分SDHA的染色在响应组的线粒体中显著增加（图5C）。作者接着检查了代谢蛋白表达与T细胞浸润之间的关联（图5C和5D）。与这些患者中更高的疗效相一致，作者发现CD8或CD3 T细胞染色与特征蛋白ACOT1，ACAT1和HADHA之间具有高度相关性（图5C）。总而言之，这些结果证明肿瘤线粒体代谢与细胞免疫原性之间存在明确的联系，这值得进行下游功能研究。图5 | 代谢蛋白和T细胞浸润的组织水平验证4. 黑色素瘤细胞免疫原性代谢调控的功能验证除了代谢特征和免疫响应之间的相关性之外，作者考虑线粒体代谢是否在增加肿瘤免疫原性方面具有功能性作用。为了诱导增加培养细胞的线粒体呼吸，作者用丙酮酸脱氢酶激酶的抑制剂二氯乙酸（DCA）处理了四种黑色素瘤细胞系，这增加了进入线粒体的碳通量。经DCA处理的细胞蛋白质组学分析显示，涉及抗原呈递的多种蛋白质表达增加（图6A）。在MHC I类蛋白中，大多数DCA处理后的黑色素瘤细胞系中HLA-A表达略有降低，而HLA-B和HLA-C显著升高，并且主要的抗原呈递因子TAP1，TAP2和B2M在不同的细胞系中显示出不同的行为。根据蛋白质组学结果，作者发现DCA处理可增加细胞表面HLA的表达，并增加mRNA表达水平（图6B-6D）。这些结果表明代谢状态不仅与治疗的响应相关，而且在增加总体抗原呈递方面具有调节作用。为了直接在特征蛋白和抗原呈递之间建立联系，作者使用了CRISPR-Cas9系统在WM266-4和Mel526黑色素瘤细胞系中敲除了两个TIL特征基因ACAT1和HADHA。此外，在同种细胞中敲除了脂肪酸氧化的主要调节剂CPT1A。蛋白质组学分析显示，与敲除细胞相比，对照组中的抗原呈递和IFN信号以及氧化磷酸化和电子传递链过程显著富集（图6E）。对基因扰动的下游影响的研究表明，在Mel526细胞中敲除ACAT1，HADHA或CPT1A后，MHC I类强度降低，HLA II类呈递细胞百分比降低（图6F，6G）。蛋白质组学分析进一步验证了这些结果，并显示了其他关键抗原呈递机制蛋白在两组间具有更高的比值（图6H）。这些结果表明，即使是TIL特征蛋白中的单个线粒体蛋白也可以影响抗原呈递机制和MHC I类表达。图6 | 抗原呈递的代谢控制代谢对抗原呈递的作用说明这些可能影响T细胞识别和肿瘤细胞杀伤。为了检验这一假设，作者将敲除组或对照组黑色素瘤细胞与匹配的T细胞共培养，并通过LDH分泌监测细胞死亡。与抗原呈递机制蛋白下调相一致，在ACAT1，HADHA和CPT1A敲除后，特异性T细胞的杀伤力明显降低（图7A）。为了通过体内小鼠模型检查这些效应，作者敲除了小鼠黑色素瘤细胞系YUMMER1.7中的Acat1，并监测其对免疫活性小鼠的肿瘤生长和免疫浸润的影响。结果表明敲除Acat1后肿瘤生长显著增加（图7B）。基于体外观察结果，作者假设敲除Acat1减少了T细胞识别，从而促进了肿瘤的进展。实际上，敲除Acat1的肿瘤细胞在RNA和蛋白质水平上均显示MHC I类和PD1配体（Pdl1）表达的显著降低（图7C–7F）。此外，与IFNG一起孵育24小时后，敲除细胞显示出对MHC I类，Pdl1和B2m的诱导作用降低（图7G）。免疫细胞谱分析显示，与对照相比，敲除Acat1的肿瘤中细胞因子产生的T细胞（cytokine-procing T cells）水平较低（图7H和7I），而浸润CD4 +和CD8 + T细胞的总百分比没有变化（图7I-7L）。此外，敲除Acat1的肿瘤中单核细胞髓样细胞（monocytic myeloid cells）的比例显著低于对照（图7M），而巨噬细胞的比例显著上升（图7N）。总的来说，这些结果说明了这些蛋白质作为影响黑色素瘤和免疫细胞调节剂的重要性。图7 | CRISPR敲除对肿瘤免疫原性和T细胞活性的影响研究结论免疫疗法彻底改变了癌症的治疗方法，但是大多数患者没有响应。本文通过蛋白质组学研究来自肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）治疗或抗PD1免疫治疗的晚期黑色素瘤患者的临床样品。统计分析表明在两种治疗中，响应组的氧化磷酸化和脂质代谢均高于非响应组。为了阐明代谢状态对免疫响应的影响，作者在代谢扰动或CRISPR-Cas9敲除后检查了黑色素瘤细胞。这些实验结果表明脂质代谢是通过提高抗原呈递而增加黑素瘤免疫原性，从而增加了对T细胞杀伤的敏感性。总的来说，蛋白质组学分析揭示了黑色素瘤代谢状态与免疫治疗响应之间的关联，这可能有助于将来改善治疗响应。小鹿推荐本文作者通过对两种免疫疗法患者组织样本的蛋白质组学分析，提出黑色素瘤细胞的代谢状态通过抗原呈递机制的内在变化和肿瘤微环境的外在变化来影响T细胞杀伤。这些结果为复杂的免疫代谢网络增加了新的认知，这可能具有重要的治疗意义。蛋白质组学在肿瘤研究领域进展迅猛，已有多种肿瘤的研究成果发表于顶级学术期刊。本文也又一次证明了蛋白质组学在生命科研领域研究中的重要作用。鹿明生物上海鹿明生物科技有限公司，一直专注于生命科学和生命技术领域，是国内早期开展以蛋白组和代谢组为基础的多层组学整合实验与分析的团队。经过近数年的发展沉淀，公司建立起了iTRAQ/TMT、4D-DIA、4D-PRM、修饰蛋白组学等蛋白组学技术平台,同时为加强学术交流，鹿明生物公众号也会一直为各位老师分享更多科研干货，欢迎关注鹿明生物官微哦~~猜你还想看◆蛋白质组学前处理方法大揭秘！学会了这几招之后“包治百病”~◆盘点 | 医学方向2020年度最佳项目文章TOP5，总影响因子：61.414◆跨年项目文章 | 两篇连发~转录组+蛋白组学对水生生物中纳米塑料毒性机理研究◆项目文章 | iTRAQ定量蛋白组学助力南京农大茶树抗寒机制研究END文章来源于鹿明生物

前言阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种以进行性记忆力减退、认知功能下降和人格改变为主要临床表现的中枢神经系统退行性疾病，是老龄人口中发病率最高的疾病之一。2020年4月13日， 美国埃默里大学Allan I. Levey教授及其合作团队再次在国际专业学术期刊《Nature Medicine》(IF =30.641)发表了最新研究成果，报道了迄今为止最大的阿兹海默症相关蛋白质组学研究。研究人员运用定量蛋白质组学技术、加权共表达网络分析、靶向蛋白质组技术（PRM）对健康人和阿兹海默症患者的2,000多个人脑组织样本和近400个脑脊液样本进行系统分析，研究确定了反映大脑生物过程的关键蛋白质共表达网络，为阿尔兹海默症的临床诊治提供了新的治疗靶标和生物标志物。标题：Large-scale proteomic analysis of Alzheimer’s disease brain and cerebrospinal fluid reveals early changes in energy metabolism associated with microglia and astrocyte activation研究对象：认知健康、正常衰老的个体、AD患者的脑组织和脑脊液期刊：Nature Medicine影响因子：30.641发表时间：2020年4月13日研究背景阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease, AD）以β-淀粉样蛋白（amyloid-β, Aβ）过度沉积和Tau蛋白异常磷酸化为主要发病机理的神经变性疾病。然而对于AD病理生理学机制还不完全了解。研究思路文章亮点1、样本珍贵：尸检脑组织样本；2、大样本量：约2000个组织样本和400个脑脊液样本；3、多种技术：LFQ、TMT定量蛋白质组学、PRM和SRM蛋白验证等；4、多个中心：至少7个采样中心，BLSA，Banner，MSSB，ACT，Mayo，ROS/MAP，UPenn等；5、多种组织类型：3种组织样本：FLPFC背外侧前额叶皮质、temporal cortex颞叶皮质、precuneus楔前叶，以及脑脊液CSF；6、多种疾病类型：主要是AD的，还检测了其他神经退行性疾病，比如：肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶变性伴TDP-43病理(FTLD-TDP)、进行性核上性瘫痪(PSP)、皮质基底部变性(CBD)、帕金森病和帕金森病痴呆(PD/PDD)和多系统萎缩(MSA)等。寻找AD致病最相关、以及最特异的区域/细胞/蛋白；7、采用WGCNA分析，将几千个蛋白与临床相关指标进行关联分析，得到不同功能的蛋白模块集；8、将大脑中不同细胞类型的marker基因跟不同模块集进行比对，从而形成细胞类型-蛋白模块-功能这样的关联集。（类似于单细胞测序的将marker基因跟细胞亚类和功能与疾病做关联）；9、实验设计逻辑严密、故事性强。研究内容本研究使用定量蛋白质组和加权共表达网络分析对AD进行了迄今为止最大的蛋白质组学研究。从4个研究中心收集了44例巴尔的摩衰老纵向研究（BLSA）、178例版纳太阳卫生研究所（BANNA）、166例西奈山医学院（MSSB）和65例成人思维变化研究（ACT）非北侧前额叶皮质（DLPFC）组织，总共453例对照、无症状AD (AsymAD)和AD。采用无标记定量（LFQ）对组织进行定量蛋白质组学分析，共鉴定到5688个蛋白。通过回归分析消除了年龄、性别和死后间隔（PMI）对蛋白质定量数据的影响，最终确定3334个蛋白利用加权相关网络分析算法构建蛋白共表达网络。加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-Expression Network Analysis，WGCNA）是一种适合进行多样本复杂数据分析的工具，通过计算基因/蛋白间表达关系，鉴定表达模式相似的基因/蛋白集合（mole），解析mole与样品表型之间的联系，绘制集合中基因/蛋白之间的调控网络并鉴定关键调控基因/蛋白。对鉴定到的3334个蛋白进行WGCNA共表达分析，将其分为13个模块。研究结果① 构建AD共表达网络模块为了评估这些共表达模块是否与AD相关，将模块蛋白表达水平与AD、淀粉样β斑块和神经纤维缠结的神经病理学特征相关联。观察到六个模块与所有病理、认知和功能测量显著相关：模块M1突触、模块M3线粒体、模块M4糖代谢、模块M5细胞外基质、模块M6细胞骨架和模块M10 RNA结合/剪接。M4糖代谢模块显示出最强的AD性状相关性（认知r=-0.67，P=8.5×10-23；神经纤维缠结r=0.49，P=4.7×10-27；淀粉样β斑块r=0.46，P=1.3×10-23；功能r=0.52，P=2.6×10-12）。因为大脑中许多蛋白质共表达的改变可以由细胞类型的改变驱动，因此分析了每个共表达模块是否富含在特定的细胞类型中。同时为了将每个模块的细胞类型特性纳入其描述中，随后将那些细胞类型丰富的模块称为“M1突触/神经元”模块、“M2髓鞘/少突胶质细胞”模块、“M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢”模块和“M5内皮/微细胞外基质”模块。进一步研究表明在AD临床前期的病理过程中，M3线粒体和M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块的病例状态差异最大。图1 | 无症状和有症状AD脑的蛋白质网络分析（a）用WGCNA和差异丰度对对照组和AD患者（N=453）脑组织蛋白水平分析；（b）从四个独立的队列中测量的3334个蛋白质中产生了由13个蛋白质模块组成的蛋白质相关网络。② AD network与脑区、年龄、其他神经退行性疾病的关联性分析进一步分析了这些共表达模块与不同脑区、年龄、其他神经退行性疾病的相关性，发现所有的模块都与颞叶皮层相关，12个模块与楔前叶相关。M1突触/神经元模块蛋白随着年龄增加其表达水平显著降低，M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块蛋白随着年龄增加其表达水平显著升高。在FTLD-TDP和CBD病例中，M1突触/神经元和M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块蛋白表现出显著变化。图2 | 分析AD患者年龄与网络模块蛋白的相关性（a）在不同年龄死亡的认知健康人群中测定DLPFC中的蛋白质水平，并用于分析AD蛋白质网络模块随年龄的变化；（b）为每个AD网络模块创建一个合成的特征蛋白，并按年龄组测量，以及与老化脑队列中的年龄相关。显示了模块M1、M3、M4和M10的合成特征蛋白分析。③ 采用PRM验证共表达网络模块蛋白的表达为了进一步验证上述研究发现，采用PRM蛋白验证对324个蛋白进行靶向验证，分析表明组学结果和PRM靶向验证结果具有很好的一致性。采用GWASs分析AD模块蛋白是否为AD疾病相关的风险因子，分析发现模块M2和M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块与AD疾病风险显著相关，表明这些蛋白共表达模块所反映的生物功能或过程可能在AD中起致病作用。鉴于M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块与AD有很强的相关性，对该模块进行了更深入的研究。小胶质蛋白markers通过表达上调来响应淀粉样β斑块，表达下调来发挥抗炎症作用。图3 | M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块富含AD遗传危险因素和抗炎症相关小胶质细胞标志物（a）采用GWASs分析AD模块蛋白是否为AD疾病相关的风险因子；（b）AD蛋白网络模块中星形胶质细胞（顶部）和小胶质细胞（底部）表型标记的富集；（c）模块M4中按模块特征蛋白相关值（kME）排列的前100位蛋白的互作网络分析；（d）AD小鼠模型中与M4模块中的蛋白质重叠的前30个差异最大的小胶质细胞的转录表达情况；④ M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块蛋白的表达水平在脑脊液中显著增加为探讨M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块中的蛋白质是否可以作为AD体液样本的生物标记物，作者分析了两个队列的脑脊液（CSF）样本的TMT标记定量蛋白质组学。在队列1中，观察到22个蛋白映射到M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块。其中CD44、PRDX1、DDAH2、LDHB和PKM蛋白显著差异性表达。在队列2中，27个蛋白映射到M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块。其中17个蛋白与队列1中重合，且在AD-CSF中表现出相同的表达趋势，在AsymAD患者的CD44、LDHB和PKM也出现显著或趋势性升高，并与认知功能相关。总之，M4节点蛋白CD44、PRDX1和DDAH2在AsymAD和AD患者中的表达显著升高。这些蛋白质也可能作为液体中的生物标志物，在疾病早期提示疾病存在。基于这些数据和分析，研究人员可以从中找出能够治疗和预防AD的新靶点，或是开发液体检测可用的生物标记物。图4 | M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块蛋白水平在AsymAD和AD-CSF中升高（a）两组脑脊液M4蛋白的分析方法；（b）测定相对蛋白水平；研究结论作者通过基于MS的蛋白质组学对2000多个大脑和近400个脑脊液样本的综合研究，提供了阿兹海默症的蛋白质网络变化和与疾病无症状和症状阶段相关的生物学变化，并强调了蛋白组学在疾病发病机理研究中的重要作用。针对这一生物学特性的项目有望用于阿兹海默症药物治疗和生物标记物开发，特别是针对促炎和抗炎星形胶质细胞和小胶质细胞的项目。作者简介Allan I. Levey博士，Emory University神经学系教授Allan I. Levey博士是埃默里大学(Emory University)神经学系教授和系主任，也是埃默里老年痴呆症研究中心(Emory Alzheimer 's Disease Research Center)主任。Levey博士是国际公认的神经生物学专家，在神经退行性疾病方面做出了诸多原创性工作。他发表了270多篇研究论文。他的工作有助于理解包括阿尔茨海默病和帕金森病在内的神经退行性疾病的大脑系统和机制，并为新的治疗策略确定分子靶点。他获得多个奖项,包括Derek Denny-Brown Neurological Scholar Award, Heikkila Research Scholar Award及 Health Advancement Research Award。Levey博士还被评为ISI神经科学领域的高引用研究员，并一直被列为美国最好的医生之一。参考文献Johnson ECB et al. Large-scale proteomic analysis of Alzheimer’s disease brain and cerebrospinal fluid reveals early changes in energy metabolism associated with microglia and astrocyte activation. Nature Medicine. 2020 Apr 13. doi:10.1038/s41591-020-0815-6END

编者按：在新一年的开端，小鹿首先要祝愿所有的科研工作者新年快乐，愿在这一年中心想事成，科研文章都上榜SCI~~本期，小鹿推出时下热点技术DIA技术，通过热门技术与前沿科技相结合，用3篇影响因子总计66分的文章告诉您DIA技术的应用。DIA技术用于永久定量数字保存对科研研究者来说，科研样本对研究起着决定性的因素。微量样本、独特样本、珍贵样本、甚至有些样本是难以获取的，针对这些样本可能由于研究时间局限性，样本收集不全面，样本失效等损失会带来课题延期、重制样、甚至错失发文先机。本篇由苏黎世联邦理工学院Ruedi Aebersold教授团队在Nature Medicine杂志（IF=30.641）发表题为“Rapid mass spectrometric conversion of tissue biopsy samples into permanent quantitative digital proteome maps”的研究论文，该研究提出了一个方法，可以快速稳定地将组织样本转化为一份数据文档，永久地存贮这个样本经质谱分析得到的蛋白质组结果。影响因子：30.641材料：组织活检样品 发表期刊：Nat.Med.主要技术：PCT-SWATH/DIA中文标题：将组织活检样品快速质谱转换为永久定量数字蛋白质组图谱这篇文章中，作者用PCT-DIA技术方法将来自9个肾癌病人的18个组织切片分别转化为(DIA)SWATH-MS多肽离子碎片谱图，并从这些谱图中对2000个蛋白样本进行定性和定量分析。作者发现肾组织切片的蛋白质组测序结果具有很好的可重复性，而且能完全将肾癌病人和健康人，以及不同组织形态的肾癌亚型区分开来。该方法特别适合大队列（几十上百甚至上千个样品）、少量样品（比如组织活检样品）蛋白组批量分析。2DIA技术在定量准确性和重现性上的优势严格说来：人体各系统器官的疾病都可以在血液当中有一定的呈现，通过测定血液中的蛋白可反映病人的生理病理状态。因此，运用质谱技术来测定蛋白定量的准确性和重现性成了研究的焦点。本文发表在《Theranostics》上由国家蛋白质科学中心的于晓波教授、广东省中医院卢传坚教授、西湖大学郭天南研究员等合作发表的In-depth serum proteomics reveals biomarkers of psoriasis severity and response to traditional Chinese medicin，详细的总结了运用DIA技术对血液标志物进行探索，进一步的验证DIA 技术在定量的准确性和重现性的优势；材料：血清影响因子：8.063发表期刊：Theranostics主要运用技术：DIA技术、抗体微阵列中文标题：血清蛋白质组学鉴定银屑病及其中药疗效的生物标志物英文标题：In-depth serum proteomics reveals biomarkers of psoriasis severity and response to traditional Chinese medicin本文通过DIA技术和抗体微阵列技术，以银屑病为疾病模型，对银屑病治疗前、银屑病中药（银屑灵）治疗后、健康对照共50例血清样本建立蛋白质表达谱。鉴定到了106种参与血液凝固、炎症、细胞凋亡和血管生成等银屑病相关生物过程的差异蛋白。聚类和主成分分析发现58种蛋白可区分健康组和银屑病患者，12种蛋白可预测中药治疗效果，相关性分析发现三个血清蛋白（PI3，CCL22，IL-12B）与银屑病面积和严重程度指数（psoriasis area and severity index, PASI）评分呈正相关。质谱DIA技术适合大规模临床样本的检测，抗体微阵列技术可补充质谱无法鉴定到的血清低丰度蛋白，本文结合DIA技术和抗体微阵列技术研究血液生物标志物的思路值得借鉴。3DIA技术与人工智能相结合2019年11月，英国剑桥大学生物化学系和米尔纳治疗学研究所（Department of Biochemistry and The Milner Therapeutics Institute, University of Cambridge）等多家机构在一区期刊Nature Methods（IF=28.467）发表题为“DIA-NN：通过神经网络和干扰校正实现高通量蛋白质组的深度覆盖”的文章，该文章作者提出了一种方便的集成软件包DIA-NN，它利用深层神经网络和新的量化及信号校正策略来处理DIA蛋白质组学的实验结果。DIA-NN提高了传统DIA蛋白质组定性和定量的能力，特别在高通量应用方面具有快捷的优势，与快速色谱方法结合使用时能够对蛋白质实现准确的深度覆盖。影响因子：28.467发表期刊：Nature Methods运用技术：DIA蛋白质组学中文标题：DIA-NN：通过神经网络和干扰校正实现高通量蛋白质组的深度覆盖软件版本：DIA-NN（1.6.0）、OpenSWATH18、Spectronaut、Specter、Skyline平台：QExactiveTM HF（Thermo Fisher Scientific ）、TripleTOF 6600 (SCIEX)材料：酵母蛋白提取物、人脐带血血浆、酶解的人K562细胞裂解物、Hela细胞蛋白提取物、大肠杆菌蛋白提取物在DIA-NN中引入的计算方法稳定且显著地增加了不同复杂度样品及不同质谱平台上获得定性和准确定量的肽和蛋白质的数量。DIA-NN首次通过使用短色谱梯度实现了蛋白质组的全面覆盖，从而显著缩短了质谱仪的运行时间，为以前无法实现的对高通量蛋白质组进行快速而精确的测量打开了大门。鹿明生物自2017年初建立了DIA、PRM等蛋白组学技术平台，是国内早期开展DIA/PRM技术服务的领跑者；近2余年来，鹿明生物积累了丰富的DIA、PRM蛋白组学等组学项目经验，公司采用高端精密的仪器设备Thermo QE-HF等，迄今为止，鹿明生物已处理DIA+PRM项目样品3000+例，拥有丰富完善的项目经验；目前鹿明生物也已经自主研发了大容量水稻DIA数据库及深度水稻磷酸化DIA数据库、PCT-DIA技术等希望能够为您的科研助力添彩；目前鹿明生物也推出蛋白组学检测+验证一体化--1+1>2的蛋白组学黄金组合服务:DIA +PRM技术，具体可扫码添加技术交流群哦~~鹿明生物上海鹿明生物科技有限公司，一直专注于生命科学和生命技术领域，是国内早期开展以蛋白组和代谢组为基础的多层组学整合实验与分析的团队。经过近数年的发展沉淀，公司建立起了iTRAQ/TMT、DIA、PRM、修饰蛋白组等蛋白组学技术平台和全谱代谢组、靶向代谢组、拟靶向代谢组、脂质组等代谢组学技术平台以及相应的数据整合分析平台，并建立了科学完整的服务流程和精细规范的操作标准。公司拥有：SCIEX-QTRAP-6500,SCIEX-QTRAP-6500 plus，SCIEX-QTRAP-4000,Waters Xevo G2-XS,Thermo-TSQ-Altis,Thermo-Obritrap-QE,Thermo-Obritrap-QE-HF,Aglient-GCMS-7890B/5977A,AglientGCMS7890B/5977A（带顶空进样装置）及云计算分析平台等大型检测设备以及完整的样品前处理系统和数据分析系统（拥有各类分析软件及数据库）。公司荣获国家高新技术企业，通过ISO9001认证，获得代谢组学专利及软件著作等近20余项知识产权专利；同时也取得上海市公共技术服务平台资质认证，获得上海市创新创业计划大赛支持。迄今为止，鹿明完成服务项目上万个，涉及医学、农业、生态学及工业应用等多个研究领域，发表SCI论文数百篇。2017年6月，公司与上海欧易生物医学科技有限公司实现战略整合，实现中心法则上中下游多层组学的串联，整合后的鹿明力求打造优质技术平台，争做优质蛋白代谢服务企业，助力生命科学领域的科学家快出成果，出好成果，从而推动科技创新。鹿明生物，多层组学定制服务专家，为您的科研助力！END

编者按热休克蛋白是一类分子伴侣蛋白，在应激过程中参与蛋白质折叠、细胞周期调控、细胞保护等功能。通过对热休克蛋白的综合分析将有助于药物的研发和癌症的治疗。随着质谱技术在蛋白质组学分析中的广泛应用，却未能解决目前热休克蛋白主要依赖于低通量WB分析的问题。本期文章利用MRM/PRM模式的靶向蛋白质组学分析方法为复杂样品定量分析提供了更好的准确性和特异性。前言本篇为来自加州大学河滨分校化学系Yinsheng Wang教授团队在Analytical chemistry 上发表的题为"靶向蛋白质组学方法分析热休克蛋白揭示DNAJB4为黑色素瘤转移的抑制剂"研究文章。该文章基于PRM靶向定量蛋白质组学方法对热休克蛋白研究，并进一步应用该方法来评估黑色素瘤转移过程中HSPs的变化。材料：黑色素瘤细胞系影响因子：6.35发表期刊：Analytical Chemistry主要技术：PRM技术 靶向蛋白质组学中文标题：靶向蛋白质组学方法分析热休克蛋白揭示DNAJB4为黑色素瘤转移的抑制剂英文标题：A Targeted Proteomic Approach for Heat Shock Proteins Reveals DNAJB4 as a Suppressor for Melanoma Metastasis研究背景热休克蛋白是参与蛋白质折叠的分子伴侣蛋白。本研究通过PRM技术靶向定量人体热休克蛋白质组。该方法覆盖约70％的人体热休克蛋白质组，并展示出比鸟枪法蛋白质组学更高的通量和灵敏度。随后通过PRM技术评估三对原发性/转移性黑色素瘤细胞系中热休克蛋白的差异表达。在每对细胞系中可定量约45个热休克蛋白，定量结果显示DNAJB4在三个转移性黑色素瘤细胞系中下调。TCGA数据表明DNAJB4的低表达预示着黑色素瘤患者不良预后。而且发现DNAJB4通过减少基质金属蛋白酶2和9（MMP-2和MMP-9）的表达和活性从而抑制培养的黑色素瘤细胞的侵袭。本研究首次通过靶向蛋白质组学建立了人类热休克蛋白质组，并发现DNAJB4是黑色素瘤转移的抑制剂。研究方法1）细胞培养2）siRNAs测序3）LC-PRM分析4）TCGA数据分析研究结果 1.热休克蛋白高通量PRM定量分析方法的建立作者通过建立一种基于平行反应监测（PRM）的高通量分析方法，定量分析人类热休克蛋白组。作者首先构建了PRM数据库，利用shotgun蛋白质组学对来自人类组织中的不同细胞系被消化的胰蛋白酶混合物分析，获得热休克蛋白肽的保留时间、MS和MS/MS数据。通过200多次的LC-MS/MS鉴定到11879个蛋白。通过筛选确定了可定量热休克蛋白数目及覆盖率（图1）。图1 |可定量热休克蛋白数目及覆盖率2.LC-PRM分析显示黑色素瘤转移过程中热休克蛋白的差异表达为了评估黑色素瘤转移过程中热休克蛋白组的重新编程，作者在PRM模式下运用靶向蛋白组学方法来评估三对的原发性/转移性黑色素瘤细胞（（即WM-115/WM-266-4、IGR-39/IGR-37和WM-793/1205Lu）中HSPs的差异表达。图2）图2 | 靶向蛋白质组方法的实验策略在WM-115/WM-266-4对黑色素瘤细胞系中量化了48个独特的HSP（图3a）。热休克蛋白的所有定量肽在库中观察到的保留时间和iRT之间表现出良好的线性拟合。此外，对比鸟枪蛋白质组分析获得的MS/MS中发现的相同片段离子，表明此方法对于肽具有高度的识别。图3 | WM-115/WM-266-4对黑色素瘤细胞热休克蛋白的差异表达同时，所有量化的热休克蛋白都出现在正向和反向硅烷标记实验中（图4b）。从正向和反向硅烷标记实验获得的定量肽的比率显示出良好的线性拟合（图4c）。在IGR-39/IGR-37和WM793/1205Lu配对黑色素瘤细胞中分别检测到43个和44个独特的热休克蛋白。定量结果的可靠性和重复性与从WM-115/WM-266-4配对黑色素瘤细胞获得的结果相似。对于作者的量化结果显示，相对于相应的转移性（WM-266-4、IGR-37和1205Lu）黑色素瘤细胞（图3a），7、10和20个热休克蛋白在原代细胞（分别为WM-115、IGR-39和WM-793细胞）中上调，18、8和5个热休克蛋白下调。作者也应用Western blot技术检测DNAJB4、DNAJC3和DNAJB1（HSP40）在配对的WM115/WM-266-4黑色素瘤细胞中的差异表达。从Western blot获得的比率与从PRM分析获得的比率一致（图5a），表明PRM方法能够准确地分析热休克蛋白的差异表达。同时，我们发现HSPB1 (HSP27)在A375恶性黑色素瘤细胞中具有抑制侵袭能力和分泌基质金属蛋白酶(MMPs)活性的作用，而在WM-115和IGR-39这两个黑色素瘤原代细胞中，HSPB1 (HSP27)表达上调(图4d)。图4 | 基于prm的靶向蛋白组学方法研究热休克蛋白在黑色素瘤转移过程中表达的干扰3.DNAJB4在转移性黑色素瘤细胞中普遍下调，并调节培养黑色素瘤细胞的侵袭能力如上所述，作者利用PRM方法揭示了已知的黑色素瘤转移抑制因子—即HSPB1的差异表达。作者接下来研究是否有其他差异表达的热休克蛋白可能作为黑色素瘤转移的驱动或抑制因子。作者发现DNAJP4在所有三个转移性黑色素瘤细胞中相对于相应的原发性黑色素瘤细胞均下调，作者通过Western blot分析证实了这一点（图5a-c）。此外，癌症基因组图谱（TCGA）数据的Kaplan-Meier生存分析显示，DNAJP4基因mRNA表达水平较低的黑色素瘤患者预后较差（图5d），表明DNAJP4可能抑制黑色素瘤转移。图5 | DNAJB4在转移性黑色素瘤细胞中下调在此基础上，DNAJB4先前被证明是肺癌转移的抑制因子。为了探讨DNAJB4在黑色素瘤转移中的潜在作用，作者接下来研究了DNAJB4的表达水平如何调节WM-115和WM-266-4细胞的迁移和侵袭能力。作者的研究结果显示，使用siRNA研究DNAJB4的表达后，WM-115细胞的侵袭能力显著增强（图6a）。相反，DNAJB4异位过表达导致WM-266-4细胞侵袭能力降低（图6a）。然而，通过基因调控DNAJB4的表达水平，WM-115和WM-266-4细胞的迁移能力未见明显改变（图6b）。同样，我们发现DNAJP4的异位过表达尽管没有观察到迁移能力的明显改变（图6b），却导致了其他两个转移性黑色素瘤细胞系（即IGR-37和1205Lu细胞，图6a）侵袭能力的显著降低。此外，siRNA介导的DNAJB4在其他两种原发性黑色素瘤细胞系（即IGR-39和WM-793）中的敲除导致迁移和侵袭能力显著提高（图6a、图6b）。以上结果提示，DNAJB4可抑制培养细胞的黑色素瘤转移。图6 | DNAJB4调节黑色素瘤细胞的侵袭能力4.DNAJP4通过调节基质金属蛋白酶抑制黑色素瘤细胞侵袭证明了DNAJB4在抑制黑色素瘤细胞侵袭能力方面的作用后，作者接下来探讨了DNAJB4调控黑色素瘤细胞侵袭能力的机制。基质金属蛋白酶（MMPs）是一种与癌症相关的的内肽酶，在降解细胞外基质（ECM）蛋白和促进肿瘤转移方面发挥着重要作用。此外，转移癌细胞的MMPs水平往往比原发癌细胞高。在人类MMPs中，MMP-2（明胶酶A）和MMP-9（明胶酶B）是两种主要的蛋白酶，它们负责重塑ECM环境和促进肿瘤转移。为了研究MMP-2和MMP-9在DNAJB4介导的黑色素瘤细胞侵袭能力改变中的潜在作用，我们用明胶酶谱分析法评估了DNAJB4表达水平对黑色素瘤细胞分泌MMP活性的影响。作者的结果表明，在DNAJB4异位高表达的转移性黑色素瘤细胞系（WM-266-4、IGR-37和1205Lu）中，分泌MMP-2和MMP-9的活性降低（图7）。另一方面，sirna介导的DNAJB4基因敲除导致三种原发性黑色素瘤细胞（WM-115、IGR-39和WM-793）MMP-2和MMP-9活性显著升高。图7），表明DNAJB4抑制分泌MMPs的活性。图7 | DNAJB4调节MMP-2和MMP-9的酶活性作者还通过qRT-PCR评估了黑色素瘤细胞中MMP2和MMP9基因的mRNA表达水平是如何被DNAJB4的表达水平调节的。作者的结果表明，在转移性黑色素瘤细胞系（WM-266-4、IGR-37和1205Lu）中，DNAJP4的异位过表达抑制了MMP2和MMP9基因的表达。siRNA介导的DNAJB4在原发性黑色素瘤细胞（WM-115、IGR39和WM-793）中的敲除诱导MMP2和MMP9的mRNA表达水平升高。DNAJB4可能通过抑制MMP-2和MMP-9基因的转录和抑制分泌MMP的活性来抑制黑色素瘤的转移。研究结论在这项研究中，作者首次开发了一种基于PRM的靶向定量蛋白质组学方法，用于人类细胞热休克蛋白质组的综合分析。PRM文库包含57个热休克蛋白，约占人类热休克蛋白组的70%。结果表明，该方法比鸟枪蛋白质组法具有更高的高通量和更高的灵敏度。靶向蛋白质组学方法发现了新的潜在黑色素瘤转移抑制剂，这为了解黑色素瘤进展的病因提供了重要依据。小鹿推荐本文为PRM技术的又一典型应用。研究者关注某一家族蛋白，或者某一类蛋白在实验组中的整体变化，可通过PRM技术靶向定量这些蛋白质。相对于LC-MS/MS，PRM靶向定量有着更高的灵敏度、更高的目标蛋白鉴定率，以及更准确的定量结果。本文通过PRM技术靶向定量原发性及转移性黑色素瘤细胞系中热休克蛋白，发现并验证了DNAJB4可作为黑色素瘤转移的抑制剂。部分文献参考(1) Feder, M. E.; Hofmann, G. E. Annu. Rev. Physiol. 1999, 61, 243-282.(2) Wu, J.; Liu, T.; Rios, Z.; Mei, Q.; Lin, X.; Cao, S. Trends Pharmacol. Sci. 2016, 38, 226-256.(3) Trepel, J.; Mollapour, M.; Giaccone, G.; Neckers, L. Nat. Rev. Cancer 2010, 10, 537-549.(4) Pick, E.; Kluger, Y.; Giltnane, J. M.; Moeder, C.; Camp, R. L.; Rimm, D. L.; Kluger, H. M. CancerRes. 2007, 67, 2932.(5) Koga, F.; Kihara, K.; Neckers, L. E. N. Anticancer Res. 2009, 29, 797-807.END

蛋白互作的研究背景内容比较丰富，我们分成两期定量蛋白质组学非标记定LabelFree定量蛋白质组学技术研究蛋白互作的背景进行介绍。本期我们接着说蛋白-蛋白互作方法的研究背景。蛋白互作方法的研究背景免疫印迹或免疫沉淀逐渐转向使用质谱法进行样本中的蛋白质定量，同时，也可使用该方法进行蛋白质鉴定。质谱法为高度复合的定量分析创造了条件，为它们的快速发展提供了条件，无需考虑费时的基于抗体的方法。LC-MS/MS还促进了研究人员对蛋白质异构体和翻译后修饰（PTMs）如何控制和调节多个细胞的了解。在蛋白质互作分析中，亲和纯化与多种定量质谱方法相结合非常常见。在本文中，我们将质谱采集策略分为“数据相关采集（DDA）”和“数据独立采集（DIA）”。目前为止，DDA最常见的用途是通过“鸟枪”技术鉴定化合物。在这些实验中，根据一组简单的启发式规则（通常是母离子强度）选择一个母离子进行碎片化，利用从所选母离子导出的MS/MS图谱进行蛋白质鉴定（图1）。相比之下，DIA并不是根据前体离子扫描中的信息来选择要进行碎片化的离子，而是在质谱仪可见范围内使整组前体离子碎片化，选择离子进行碎片化的方式区别对量化结果有重要影响。图1. QqTOF仪器中典型“鸟枪”实验的示意图。仪器在两种不同的扫描模式之间循环。（A） 在第一模式（MS1）中，所有离子都通过仪器传输，并在检测器处检测，随后可用于母离子测定。利用简单的规则（强度、电荷状态和离子是否已经碎裂）分析导出的质谱图。通过这些规则的离子随后被分离和碎片化。（B） 在MS/MS模式下，特定质量在第一个四极体中分离，在第二个四极体中碎片化。所有的碎片离子都被记录在分析仪中，并产生MS/MS图谱，用于鉴定化合物。质谱仪的不断创新使得检测灵敏度得到显著提高，可以检测样品中成分较少的物质。除了能够更深入地观察样品外，灵敏度的提高还可以提高仪器的扫描速度，这使得用不同的工作流程和方法进行定量和鉴定成为可能。本文我们讨论的是利用亲和纯化联合质谱技术（AP-MS）分析蛋白质-蛋白质相互作用时，肽和蛋白质的定量方法。这些方法也适用于涵盖需要量化的不同应用领域的各种其他类型样本，不过最终使用哪种方法还是由样本复杂性来决定。下期文章中，我们将切入主题，详细介绍几种目前常用的几种研究相互作用蛋白质组学的定量蛋白质组学非标记定量LabelFree法。本文由百泰派克生物科技整理编辑。百泰派克生物科技专注于基于质谱的蛋白质组学服务，结合亲和纯化与定量蛋白质组学非标记定量LabelFree、SILAC或SWATH定量技术，提供一系列定量蛋白质组研究策略，灵敏度高、重复性好，非常适合蛋白质相互作用的研究。文献参考：Stephen Tate, Brett Larsen, Ron Bonner, Anne-Claude Gingras, Label-free quantitative proteomics trends for protein-protein interactions. Journal of Proteomics, 2013.

前言2020年3月欧易/鹿明生物合作客户中国农业大学高振江教授在Food Chemistry期刊上发表题为“Radio frequency treatment accelerates drying rates and improves vigor of corn seeds”的研究成果。本研究利用iTRAQ标记定量蛋白质组学技术及其它生理生化实验技术探索了结合射频（RF）和热风干燥（HAD）技术RF-HAD在玉米种子上的应用。结果显示，RF-HAD具有加快干燥速度和提高活力的优点，因此可应用于种子干燥。此外，它还有助于更好的储存，因为它有利于种子在干燥过程中具有高活力的休眠。该研究结果将为玉米种子的工业规模干燥提供理论指导。中文标题：射频处理可加快干燥速度并提高玉米种子的活力研究对象：玉米种子发表期刊：Food Chemistry影响因子：6.306发表时间：2020年3月合作单位：中国农业大学运用欧易/鹿明生物技术：iTRAQ标记定量蛋白质组学（由鹿明生物提供技术支持）研究背景玉米（Zea mays）具有很高的营养价值和药用价值，是世界上最重要的谷物作物之一。玉米在收获时总是有很高的水分含量，种子需要干燥至安全的状态，以保持生化稳定。新鲜收获的种子通常在形态上成熟，为使胚胎发育到生理成熟，必须有一个后熟期。由于具有这种后熟功能，干燥可以保证种子质量，它也是抑制微生物生长的重要方法。在种子发芽的初级阶段，无法进行光合作用，而胚和胚乳中的营养成分（例如蛋白质，脂肪和淀粉）则为新陈代谢和呼吸提供了能量。因此，保持营养成分和种子活力势在必行，这可以通过均匀且快速干燥来实现。作为体积加热方法，射频（RF）加热可以通过分子旋转和带电离子振荡在材料内部产生热量，以便材料可以均匀加热而不会产生热梯度。但是，种子对热敏感。应用于玉米种子的射频技术的研究是有限的。很少有研究全面探索不同RF-HAD条件下干燥的玉米种子的活力，特别是与其他干燥方法相比。本研究通过干燥特性，种子活力评估和iTRAQ标记定量蛋白质组学技术对两种方法（HAD和RF-HAD）之间的干燥样品进行比较分析，以期为为玉米种子的工业规模干燥提供理论指导。研究思路研究结果1、干燥特性作者首先比较了两种干燥方法的干燥特性，结果如图1和2所示。根据图1（b）所示，在每次回火过程之后，HAD干燥速率得到了改善。通常，较短的回火间隔（意味着较高的干燥频率）导致较快的干燥速率。如图2（b）所示，在HAD的第一阶段，干燥时间为10分钟的干燥速率最低，这是因为获得的材料温度最低（约34℃），而其他材料的最低温度（超过36℃）表明那10分钟不足以加热玉米种子。虽然在干燥过程中观察到30分钟和40分钟的干燥时间达到热平衡，这表明干燥时间可能会有点多。由于干燥回火频率高，因此从样品中获得更高的干燥速率，干燥持续时间为10分钟。但是，增加的干燥回火频率不适合保留种子质量，因为获得了更多的开裂（根据表2），而降低的回火频率则会阻碍其干燥速度。因此，最佳的HAD条件应该是在40℃下干燥20分钟。图1 | 分别在HAD和RF-HAD不同干燥条件下玉米种子的干燥曲线（a）和干燥速率曲线（b）根据图1，RF-HAD玉米种子的干燥速率随电极间隙的增加而降低。如图1所示，很容易得出结论，与HAD相比，RF-HAD可以显著提高干燥速率。例如，当玉米种子干燥至水分含量为0.29（db）时，RF-HAD在电极间隙为160 mm时的平均干燥速率为0.0605 g /（g * h），而在20分钟，100分钟回火下的HAD值为0.0296 g /（g * h）。即使样品重量是HAD的三倍（630 g / 200 g = 3.15），RF-HAD的干燥时间也不到HAD的三分之一。图2 | RF-HAD样品在不同电极间隙处的温度历史曲线（a）和HAD样品在不同干燥时间下的温度历史曲线（b）2、玉米种子的韦布尔模型之后，作者利用韦布尔模型对种子的干燥过程进行模拟，β是形状参数，与干燥速率和干燥方法有关，当β大于1时，表明干燥速率在早期阶段先增加然后降低，而当β在0.3到1范围内时，干燥过程将下降。表1给出了两种干燥方法的玉米种子的Weibull模型模拟结果。标度参数α表示去除样品中63％水分的估计时间，对于HAD样品为这个时间为14.47至16.94 h，对于RF-HAD样品为5.03至5.92 h，这与RF-HAD加速干燥玉米种子比率这一事实相吻合。对于HAD样品，形状参数β小于0.706，而对于RF-HAD样品，形状参数β小于0.86。两种方法的β值均小于1，这表明玉米种子的两种干燥方法均处于降速干燥过程中。测定系数（R2）高于0.9976，表明了韦布尔模型的合理性。表1 | 两种干燥方法在不同条件下的威布尔模型仿真结果根据表1，随着HAD干燥时间的延长或RF-HAD电极间隙的增加，Dcal，W和Deff，F均大致降低。但是，RF-HAD样品的值受到RF电极间隙的影响很大，高于HAD样品，表明RF-HAD期间的内部水分迁移快于HAD过程中的水分迁移，这与干燥速率的结果一致。通过相同的干燥方法，未观察到与物理尺寸高度相关的Rg的显著差异，其原因可能是对于像玉米这样的硬皮种子而言，干燥过程中的尺寸收缩最小。3.能量消耗在给定的玉米种子初始重量（m0 = 0.63 kg）的情况下，随着RF电极间隙（dp）的减小，施加到处理过的玉米种子上的RF功率（PRFm）以及RF功率效率（η）相应增加，在RF-HAD期间，RF比能耗（eRF）降低了。在确定的电极间隙（dp = 160 mm）下，待干燥的玉米种子越多，待干燥的材料吸收的射频功率就越多，因此，功率效率（η）升高， eRF减少。考虑到与HAD相比，RF-HAD可以处理的材料量更多，因此，作者在RF-HAD中施加的初始重量也比HAD大，此外，回火后的RF-HAD比能耗要小于回火后的HAD。在本研究中，使用了极少量的玉米种子以达到更好的干燥均匀性，从而进行活力评估。因此，单位能耗相对较高。在工业应用中，将应用更大的初始重量，因为随着初始重量的增加，RF比能耗会急剧下降，因此RF-HAD在玉米种子干燥中具有潜在的优点。回火处理有助于降低单位能耗，因此，在工业应用中，由于能耗低，可以提倡回火处理。4. 活力评估然后，作者对两种干燥方法的种子活力进行评估，评价结果如表2所示。RF-HAD干燥样品的脱氢酶活性（DHA）显著高于HAD干燥样品的DHA，RF-HAD样品的开裂率（CR）值小于HAD的CR。RF-HAD可以更好地降低内部热量和水分梯度，因为降低了玉米粒中的水蒸气分压，从而减少了应力开裂并减少了胚胎损伤。但是，RF-HAD样品的发芽率（GP）小于HAD样品的GP。GP较高的种子通常显示出更好的活力，但高活力的种子并不总是表明发芽能力强。可能是因为不同的材料适应不同的发芽检测方法。一些研究建议不要使用发芽试验作为描述种子活力的唯一关键方法。种子发芽是一个复杂的过程，在此过程中需要适当的条件，包括温度，湿度和种子养分含量。但是，即使在休眠期间，即使在合适的环境中，种子也很少发芽。在这项研究中，通过RF-HAD和HAD处理确保了样品的发芽测试环境相同，但是处理后的GP和DHA的结果却相反。由于经过RF-HAD处理的未发芽种子在发芽试验后状况良好，可以推测通过RF-HAD处理的玉米种子可能进入休眠期，导致GR异常降低。表2 | 比较两种干燥方法的种子活力5.休眠对GP的影响作者进一步对休眠处理前后的干燥玉米种子GP进行分析，结果如表3显示。在两次干燥处理之后，GP均非常低，一个月后，GPs继续降低至很小的值。然而，在休眠中断处理之后，对于HAD和RF-HAD样本，GP分别观察到18％和48％的GP增量，初步表明与RF-HAD样本的高DHA相对应的低GP是由于休眠。作者在这项研究中使用的玉米种子品种表现出其在耐热性和耐干性方面的优点，它具有非常厚且坚韧的种皮，可能导致水和空气难以渗透到种子中，从而导致休眠。经过休眠处理后，具有较高DHA的RF-HAD玉米样品的GP高于预期的HAD样品，这表明RF有助于增加种子的活力和种子的GP。但是，GP仍低于可接受的标准。表3 | 玉米种子休眠试验前后的发芽率6.iTRAQ蛋白质组学分析通过iTRAQ技术进一步比较了本研究中的两个最佳样品，即RF-HAD样品在160 mm的电极间隙处干燥，以及HAD样品在40℃干燥20分钟的干燥时间。6.1:差异蛋白质鉴定（DAP）在两组样品中，共鉴定出3427种蛋白质，其中2582种蛋白质具有定量信息。在干燥样品中鉴定出78种DAP，其中与HAD干燥样品相比，RF-HAD干燥样品中48个DAPs丰度增加， 30个DAPs丰度降低。在最近的研究中，一般认为种子休眠的主要原因是皮质功能障碍，胚胎休眠和发芽抑制剂。RF-HAD样品中的许多抑制剂蛋白要比HAD样品中的抑制剂蛋白高，如抑制素，半胱氨酸蛋白酶抑制剂，木聚糖酶抑制剂蛋白和线粒体抑制剂。这可能是RF-HAD样品具有较高DHA但具有较低GP的原因。球蛋白是一种与代谢高度相关的蛋白质，RF-HAD样品中的球蛋白高于HAD样品，这与RF-HAD样品比HAD样品具有更高的活力这一事实相吻合。RF-HAD样品中某些DAP的丰度降低是与代谢相关的酶，例如蔗糖合酶，其降低表明酶促反应减弱，导致蔗糖合成减少，这在植物生长和渗透调节中起着至关重要的作用。6.2 :DAP的生物信息学分析为了识别DAP的功能特征，进行了GO注释和富集分析。如图3所示，按生物学过程，分子功能和细胞成分分类的蛋白质分为40多个功能组。在生物学过程中（图3B），蛋白质主要参与种子成熟，分解代谢过程和胚胎发育。在细胞成分组中（图3C），蛋白质主要与细胞质，液泡和膜有关。在分子功能类别中（图3D），蛋白质主要负责半胱氨酸型内肽酶抑制剂的活性，β-脲基丙酸脂酶的活性和肽酶抑制剂的活性。因此，RF-HAD可能由于分解代谢过程中的调节，细胞质或液泡组分的变化以及抑制剂的增加而帮助玉米种子休眠。图3 | RF HAD和HAD干玉米种子之间的GO注释和DAPS富集相关讨论回火过程可以在一定程度上提高HAD的干燥速率，同时延长总干燥时间。对RF-HAD的干燥特性和活力评估表明，减少的电极间隙影响了种子活力，同时降低了比能耗。对这两种方法的比较研究表明，在RF-HAD工艺中，干燥速率显著提高，即使样品重量增加三倍，其干燥时间仍不到HAD的三分之一。在RF-HAD样品中获得了较高的DHA和较低的GP。休眠处理后GP的增加表明RF-HAD干种子处于休眠状态。与HAD样品（在40℃，干燥时间为20分钟的干燥时间）相比，RF-HAD样品中鉴定出78个DAP（电极间隙为160 mm），其中48个上调，30个下调。生物信息学分析结果表明，RF-HAD样品的生物学过程、细胞成分以及酶抑制剂可能会发生变化。RF-HAD具有加快干燥速度和提高活力的优点，因此可应用于种子干燥。此外，它还有助于更好的储存，因为它有利于种子在干燥过程中具有高活力的休眠。对于玉米种子的工业规模干燥，就能耗而言，可提倡采用回火的RF-HAD。研究结论本研究利用iTRAQ标记定量蛋白组学技术及其它生理生化实验技术探索了结合射频（RF）和热风干燥（RF-HAD）技术在玉米种子上的应用，为了更好地表明将RF-HAD应用于玉米种子的可行性，对回火间歇式热风干燥（HAD）进行了比较。电极间隙的减少与平均加热速率和功率效率的提高相对应，从而导致种子活力和比能耗降低。与HAD相比，RF的帮助显著提高了玉米种子的干燥速率，并将干燥时间缩短了多达70％。与HAD样品相比，RF-HAD样品中的脱氢酶活性（DHA）较高，但发芽率（GP）较低。打破休眠结果以及iTRAQ蛋白组分析显示，玉米种子通过RF-HAD提升为休眠状态。该研究结果将为玉米种子的工业规模干燥提供理论指导。蛋白组学在食品储藏研究中的应用本篇是一篇典型的标记定量蛋白质组学在食品储存方面的应用客户文章，鹿明生物不仅可以采用iTRAQ蛋白质组学技术运用到科学研究中、同时也推出了TMTpro 16 plex标记蛋白质组学：一次可同时标记16个样本，可帮助解决您的实验设计是4组3重复，5组3重复等样本的设计；产品特点：高通量提高数据稳定性定量准确度高详情请戳：技术升级 | 鹿明生物正式推出TMTpro 16 plex蛋白组学研究技术欢迎百度搜索访问鹿明生物官网咨询另，鹿明生物也推出了针对蛋白组学的最新课程，欢迎百度搜索易明学院进行访问观看学习~猜你还想看◆鹿明生物：Cell报道丨西湖大学郭天南等首次揭示新冠患者蛋白质分子病理全景图◆鹿明生物：盘点 | 医学方向2020年度最佳项目文章TOP5，总影响因子：61.414◆鹿明生物：数据质控“小法宝”，同款Tips你值得拥有~◆鹿明生物：跨年项目文章 | 两篇连发~转录组+蛋白组学对水生生物中纳米塑料毒性机理研究END文章来源于鹿明生物

央广网北京2月28日消息（记者贾斯曼）28日凌晨，英国《自然》杂志在线发表我国研究团队在早期肝细胞癌蛋白质组研究领域取得的重大科研成果。文章测定了早期肝细胞癌的蛋白质组表达谱和磷酸化蛋白质组图谱，发现了肝细胞癌精准治疗的潜在新靶点。成果截图该成果由军事科学院军事医学研究院生命组学研究所、国家蛋白质科学中心（北京）、蛋白质组学国家重点实验室贺福初院士团队、钱小红研究员团队联合复旦大学附属中山医院樊嘉院士团队、北京大学肿瘤医院邢宝才教授团队共同完成。科研人员根据101例早期肝细胞癌及配对癌旁组织样本的蛋白质组数据，将目前临床上认为的早期肝细胞癌患者，分成三种蛋白质组亚型，而不同亚型的患者具有不同的预后特征，术后需要对应不同的治疗方案。其中，第一类患者仅需手术，要防止过度治疗；第二类患者则需要手术加其他的辅助治疗，而第三类患者占比30％，术后发生复发转移的危险系数最大，是最后的“硬骨头”。科研人员发现在第三类患者的蛋白质组数据里，胆固醇代谢通路发生了重编程，其中侯选药靶胆固醇酯化酶的高表达具有最差的预后风险。通过抑制候选药靶——胆固醇酯化SOAT1，能减少细胞质膜上的胆固醇水平，有效抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。科研人员进一步研究发现，SOAT1的一种小分子抑制剂“阿伐麦布”在肝癌患者的人源肿瘤异种移植模型上表现出良好的抗肿瘤效果，表明“阿伐麦布”有望成为治疗预后较差肝细胞癌患者的潜在靶向治疗药物。科研团队成员讨论质谱数据。（图片由军科院提供 洪楠/摄）研究团队首次发现胆固醇代谢途径重编程与肝细胞癌之间的直接联系，证实胆固醇酯化在肝癌发生中的重要意义，借助患者群蛋白质组学海量数据发现胆固醇酯化酶可用于早期肝癌的分型、预后及靶向治疗，其蛋白质水平在头颈癌、胃癌、前列腺癌、肾癌和甲状腺癌中均和患者的较差预后正相关，为发展新型抗癌药物提供了重要基础。据悉，这是2014年国家科技部全面启动“中国人类蛋白质组计划”以来，国家蛋白质科学中心（北京）首席科学家贺福初院士以通讯作者在《自然》杂志发表的第2篇标志性成果。中国是国际蛋白质组计划的重要参与者，也是人类肝脏蛋白质组计划的牵头实施方，中国科学家在肝细胞癌蛋白质组领城研究取得的这次重大突破，具有广泛的社会应用价值，是“中国人类蛋白质组计划”迎来的第一道曙光。