蛋白小分子相互作用研究方法

近日，中国科学院大连化学物理研究所研究员王方军团队在蛋白质复合物形成和干预机制分析新方法研究方面取得进展，通过溶液状态蛋白质赖氨酸两步稳定同位素标记和定量蛋白质组学分析，实现对蛋白—蛋白识别关键位点区域的精确探测，并可评估小分子对蛋白质复合物的构象识别干预情况。蛋白质的结构和相互作用决定了其生物学功能，目前对溶液状态蛋白—蛋白识别和结构动态变化研究仍然缺乏高灵敏度的分析方法。此前，研究团队发现蛋白质上赖氨酸的原位标记反应性与其所处微观结构中的氢键、静电相互作用强度密切相关；提出以蛋白质上所有赖氨酸位点为内源性反应探针，通过定量赖氨酸在蛋白—蛋白，蛋白—小分子结合前后的标记反应性变化，精确探测蛋白质识别过程中的关键区域。为进一步提高赖氨酸反应性定量分析的通量和灵敏度，该团队进一步发展了溶液状态蛋白质“活性—变性”赖氨酸两步稳定同位素标记定量策略（TILLRP），系统研究了重组SARS-CoV-2 S1蛋白质和人体ACE2受体之间的相互作用情况；发现S1蛋白质RBD Lys386-Lys462区域的赖氨酸位点在S1-ACE2复合物形成前后标记反应性发生了显著改变；提出可以利用该区域赖氨酸的标记反应性调控水平评估小分子活性物质对S1-ACE2识别的干预情况，可能有助于相关治疗药物分子的研发。该研究结果发表在《化学科学》（Chemical Science）上。上述研究工作得到国家自然科学基金、大连化物所创新基金等项目的资助。大连化物所提出蛋白质相互作用识别和干预机制分析新方法【来源：大连化学物理研究所】声明：转载此文是出于传递更多信息之目的。若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请作者持权属证明与本网联系，我们将及时更正、删除，谢谢。 邮箱地址：newmedia@xxcb.cn

药物设计格外关注配体与蛋白结合的过程，其中一个重要的部分是配体的结合构象究竟有何特点，了解这个不仅能够加深我们对结合过程动力学层面的理解，而且对于指导如何筛选和保留合理的配体构象，不管是通过构象搜索、对接还是从头设计得到的，都具有一定的现实意义。为此，笔者翻出了这篇2004年发表在Journal of Medicinal Chemistry期刊上的题为“Conformational Analysis of Drug-Like Molecules Bound to Proteins: An Extensive Study of Ligand Reorganization upon Binding”的高被引工作，来自美国波士顿的福泰制药公司的两名研究人员，Emanuele Perola和Paul S.Charifson，在这篇工作中分析了在结合构象中的配体的应变能和结合过程发生的去折叠（unfolding）现象。——目的与方法——*目的。作者希望能够得到一个可靠的标准来判断构象的生物相关性（biological relevance），即具体配体的某一个构象有多大可能是它与蛋白质结合发挥功能时的构象。这里的标准选择了配体的应变能（具体定义见下）阈值，如果超出这一阈值，那么有很大可能这个构象不是结合构象，从而可以抛弃。*测试数据集。包含150个从PDB和福泰内部数据中收集的复合物结构，挑选的标准是配体小分子是类药的（drug-like），其中有一些是上市药物。蛋白包含63种，其中有85个复合物结构中的蛋白是激酶和蛋白酶。*应变能。应变能的计算是通过OPLS-AA和MMFF两种力场，在真空和连续溶剂两种条件下，配体的结合构象与全局最优构象、最近局部最优构象之间的能量差（并分别得到全局最优应变能和局部最优应变能）。*全局最优构象和最近局部最优构象的获取。作者使用三种构象采样软件，Macromodel v8.0、Catalyst v4.6和ICM v3.0进行充分采样后整合，之后再采用上面提到的两种力场和两种条件进行能量极小化优化，得到四组构象和对应的能量：OPLS-AA/vacuum、OPLS-AA/water、MMFF/vacuum和MMFF/water。这样每一个配体能够得到四组全局最优构象，而最近局部最优构象是能量优化后与结合构象最接近的构象。*配体舒展程度（extension）的衡量。作者选择了最大原子间距和溶剂可及表面积两个指标来评估配体去折叠的程度，一个构象的舒展程度的计算是与分子最舒展时的构象的最大原子间距之比或溶剂可及表面积之比。——具体结果——*计算应变能的条件选择：是否需要溶剂模型。要获取明确的应变能标准，最好明确和统一应变能计算的条件。作者通过比较两种力场在真空和连续溶剂条件下计算的得到的应变能的相关程度（表1），发现两个条件下的应变能结果是高度相关且数值接近的，而且考虑了距离相关的介电常数的真空条件已经能够比较好地缓解分子内部的静电相互作用相比在溶液中被放大的问题（表2）。所以后续的评估中基本上只讨论真空条件下的情况。表1表2*局部最优应变能结果（图1）。在测试集上，结合构象与最近局部最优构象的能量差分布从0到16.5 kcal/mol（MMFF）/ 13.3 kcal/mol（OPLS-AA），平均应变能为1.9 kcal/mol（MMFF）/ 2.1 kcal/mol（OPLS-AA）。只有34.0%（MMFF）/35.3%（OPLS-AA）的复合物结构中，配体的结构构象是局部最优构象（标准是应变能小于0.5 kcal/mol，下同）。图1*全局最优应变能结果（图2）。在测试集上，结合构象与全局最优构象的能量差分布从0到26.2 kcal/mol（MMFF）/ 20.5 kcal/mol（OPLS-AA），平均应变能为4.0 kcal/mol（MMFF）/ 5.1 kcal/mol（OPLS-AA）。只有14.7%（MMFF）/11.3%（OPLS-AA）的复合物结构中，配体的结构构象是全局最优构象。图2*应变能与配体柔性的关系。配体分子的柔性用可旋转键数目来衡量，作者分为四组：1至3、4至6、7至9和10至12个可旋转键。作者发现应变能的范围与可旋转键数目有明显的相关关系（图3），可旋转键越多，配体的结合构象可能出现的应变能上限越高。说明需要对含有不同数量可旋转键的配体设置不同的应变能阈值来来判断构象的生物相关性。比如对于可旋转键在1至3个的配体，设置5 kcal/mol的应变能阈值筛选得到的构象中有90%的概率召回了活性构象。更加详细地可以见表3。图3表3*造成高应变能的可能原因。作者分析了高应变能的前20个结合构象，与他们对应的全局最优构象相比，发现结合构象明显更加舒展，舒展程度（在MMFF力场中）从全局最优构象的0.78（最大原子间距之比）/0.89（溶剂可及表面积之比）上升到结合构象的0.85（最大原子间距之比）/0.94（溶剂可及表面积之比）。在6个舒展程度变化最明显的情况中，有5个全局最优构象中的疏水相互作用消失了，造成了结合构象更加舒展的状态。OPLS-AA力场计算的结果也发现有类似的情况，在9个舒展程度变化最明显的情况中，有8个全局最优构象中的疏水相互作用消失了。——结论——* 配体与蛋白结合时很少以全局最优构象进行结合；* 有超过60%的情况结合构象不是局部最优构象；* 判断构象是否为活性结合构象时可以使用应变能阈值。该阈值需要根据分子中的可旋转键数目进行调整；* 在结合过程中配体可能因为破坏内部的疏水相互作用增加疏水表面，并与蛋白结合位点形成新的疏水相互作用而造成高应变能。——后续相关研究——后续的一些判断构象的生物相关性的研究中，有经过更大规模的计算分析的结果支持了使用应变能阈值作为区分的标准，但是指出结构构象是全局最优构象的可能也没有那么低，结合构象也比较容易用现在的构象采样程序采到1-2，还有很多研究重点关注和分析了扭转（torsion）造成的应变能和在结合构象中的分布倾向3-6。有兴趣的读者可以查阅附录的文献。参考文献：[Main] Perola,Emanuele, and Paul S. Charifson. "Conformational analysis of drug-like molecules bound to proteins: an extensive study of ligand reorganization uponbinding." Journal of medicinal chemistry 47.10 (2004): 2499-2510.DOI: 10.1021/jm030563w[1] Avgy-David,Hannah H., and Hanoch Senderowitz. "Toward focusing conformational ensembles on bioactive conformations: a molecular mechanics/quantum mechanicsstudy." Journal of chemical information and modeling 55.10 (2015):2154-2167.DOI: 10.1021/acs.jcim.5b00259[2] Zivanovic,Sanja, et al. "Exploring the Conformational Landscape of Bioactive Small Molecules." Journal of Chemical Theory and Computation 16.10 (2020):6575-6585.DOI: 10.1021/acs.jctc.0c00304[3] Brameld, KenA., et al. "Small molecule conformational preferences derived from crystal structure data. A medicinal chemistry focused analysis." Journal of chemical information and modeling 48.1 (2008): 1-24.DOI:10.1021/ci7002494[4] Hao,Ming-Hong, Omar Haq, and Ingo Muegge. "Torsion angle preference andenergetics of small-molecule ligands bound to proteins." Journal of chemical information and modeling 47.6 (2007): 2242-2252.DOI:10.1021/ci700189s[5] Rai, BrajeshK., et al. "Comprehensive Assessment of Torsional Strain in Crystal Structures of Small Molecules and Protein–Ligand Complexes using ab Initio Calculations." Journal of Chemical Information and Modeling 59.10 (2019):4195-4208.DOI:10.1021/acs.jcim.9b00373[6] Sellers,Benjamin D., Natalie C. James, and Alberto Gobbi. "A comparison of quantumand molecular mechanical methods to estimate strain energy in druglike fragments." Journal of chemical information and modeling 57.6 (2017):1265-1275.DOI:10.1021/acs.jcim.6b00614

神经退行性疾病的特点是错误折叠的蛋白在细胞内或细胞外聚集。在过去的十年里，研究人员发现这些与疾病相关的病理蛋白经历了细胞间的传递：在传递到受体细胞后，病理蛋白作为模板诱导其正常的内源性对应蛋白错误折叠，最终导致病理蛋白聚集体沿神经元网络扩散，这一过程被称为传递假说（cell-to-cell transmission of pathological proteins）。近日，Nat Rev Neurol首页刊登了由University of California Los Angeles的Chao Peng, John Trojanowski和Virginia Lee联合撰写的题为Protein transmission in neurodegenerative disease的综述，旨在总结支持“传递假说”的证据，并特别探讨α-syn、Aβ和tau在细胞间的传递。01，蛋白质传递的证据作者首先从四个方面证明了“传递假说”的可信性。a、 病脑中蛋白质聚集体的典型分布在PD患者中，病理性α-syn首先在嗅球以及舌咽和迷走神经的背侧运动核中发现，随后扩散到中脑和前脑，最终到达大脑皮层；在AD患者中，病理性tau从蓝斑扩散到内嗅区和海马区最后到达颞叶基底皮质、岛叶皮质和新皮质；有趣的是，病理性Aβ的扩散模式则与tau完全不同，Aβ从基底颞叶皮质发生，然后扩散到整个新皮质，最终到达海马、中脑、脑干和小脑。b、 来自于对接受胎儿脑源性细胞移植作为PD治疗方法的患者的研究对患者进行观察发现：在移植的细胞中存在α-syn聚集体，这表明宿主向移植物进行了蛋白质传递。c、实验中大量的疾病模型例如，在注射了从人脑中分理出的病理性α-syn后，M83转基因小鼠α-syn病理发展被促进，并且M83转基因小鼠表达了家族性PD相关突变形式的人α-syn蛋白。d、病理蛋白从周围神经系统到中枢神经系统的传递近一年来关于PD的研究证明，α-syn最初的错误折叠发生在肠道神经系统，并逆行扩散到脑干；科研人员已在PD患者的肠道神经系统和颌下腺中检测到病理性α-syn[2-5]；同时发现，迷走神经切断术或阑尾切除可以降低PD风险（已有证据表明，阑尾含有相当数量的错误折叠的α-syn）。同时在AD实验中，也有类似发现：口服、静脉注射、眼内和鼻腔注射含有Aβ的脑提取物给年轻的APP转基因小鼠（还没有表现出年龄相关的Aβ病理），均未能诱导脑Aβ淀粉样变性；然而，腹腔注射提取物确实促进了Aβ在这些小鼠大脑中的沉积。02，传递过程随后作者从病理蛋白的细胞内运输、释放和摄取详细描述了“传递假说”的传递过程。上图揭示了病理蛋白在细胞间传递的机制：从供体神经元中释放出来，以裸露蛋白或囊泡的形式进入胞外；受体介导的内吞作用(A)、直接穿透质膜(B)或液相内吞作用(C)可使受体神经元摄取裸露蛋白，囊泡可通过囊泡与质膜(D)的融合而内化，蛋白也可以通过直接连接两个细胞(E)的隧道纳米管从供体转移到受体。03，病理蛋白的分子性质白质传递的证据那么了解病脑中病理蛋白的分子性质对于阐明其传递机制和发育则具有重要意义。多项研究表明，具有较高传递能力的聚集体能在传递中发挥更大的作用，例如研究人员发现可溶性Aβ是比不溶性Aβ更有效的病理蛋白；同时，容易被细胞释放和内化的较小分子是更可能的病理蛋白，例如很长的α-syn纤维并不有效。而病理蛋白的构象则是研究人员所关注的重点。a、 构象多样性许多病理蛋白，α-syn、tau和Aβ都是以多种不同的构象存在于患者体内。同一病理蛋白的不同构象有可能表现出明显不同的传递能力，从而导致神经退行性疾病的病理和临床多样性。最近，低温电子显微镜被用来分析从病脑中提纯的病理蛋白的结构，为病理蛋白错误折叠和聚集过程的结构基础提供了重要信息，包括蛋白质聚集体核心的排列和组成。b、 构象和效力不同构象的病理蛋白具有明显不同的致病效力。例如，从少突胶质细胞分离的病理性α-syn和从神经元分离的病理性α-syn在构象上是不同的，少突胶质细胞来源的形式具有比神经来源形式高约1，000倍的致病效力。一个有趣的观察是，从患病大脑中分离出来的病理蛋白通常比重组病理蛋白产生的聚集体具有更强的致病效力，这表明患病大脑中的环境导致了与体外产生的蛋白相比其环境下产生的病理蛋白更具独特蛋白构象，例如，从tau病脑样本中分离出的病理性tau比合成tau纤维能引起更多的tau病变。c、构象和胶质细胞病理学病理蛋白的不同构象可能导致特定细胞类型的病理改变。例如将来自AD患者大脑的病理性tau注射到野生型小鼠中，仅在神经元中诱导tau病理；而将来自PSP患者大脑中的病理性tau同样注射到野生型小鼠中，则可在神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞中均可诱导tau病理。d、构造和扩展模式一些证据表明，病理蛋白的构象调节了这些病理蛋白沿神经网络的传递模式。下图揭示了三种病理蛋白产生机制：不同的细胞内环境影响蛋白质折叠过程；不同的细胞内环境影响模板扩增过程；如果病理蛋白是混合物，不同的胞内环境导致从混合物中选择扩增特定构象。04，影响传递过程的因素最后作者从四个方面总结了影响传递过程的因素。a、 神经元活动在一项使用光遗传和化学发生方法调节神经元活动的研究表明，在表达突变形式的人tau蛋白的小鼠中，较高的神经元活动会导致tau病理增加。b、 胶质细胞有证据表明，激活的胶质细胞促进病理性蛋白从细胞外空间的清除，从而抑制了病理性蛋白在细胞间的传递：小胶质细胞和星形胶质细胞可以吞噬可溶及不溶性的tau，也会参与Aβ清除的多种机制；同样证据表明，病理性α-syn被星形胶质细胞吞噬和清除。c、遗传风险因素众所周知，富含亮氨酸重复序列的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2（LRRK2）基因突变通常会增加激酶活性，是遗传性PD的最常见原因；LRRK2通过影响一种参与囊泡运输的GTP酶的磷酸化促进病理性α-syn在体内外的增殖。d、病理蛋白之间的相互作用、遗传风险因素在各种神经退行性疾病中，多种病理蛋白在病变脑中共存是常见的。不同的病理蛋白共存表明，一种病理蛋白可以促进另一种病理蛋白的传播：组织病理学和遗传学数据表明，Aβ斑块可以促使tau病变从内侧颞叶扩散出去。05，总结这项研究对神经退行性疾病相关的病理蛋白传递过程具有重要的治疗意义，但是未来该领域仍然面对着两大挑战：一是人工预制纤维和病理蛋白之间仍存在重要的构象和生物学差异；二是病理蛋白的构象多样性仍待发现。参考文献：[1] Peng, C., Trojanowski, J.Q. & Lee, V.M. Protein transmission in neurodegenerative disease. Nat Rev Neurol 16, 199–212 (2020).[2] Killinger, B. A. et al. The vermiform appendix impacts the risk of developing Parkinson’s disease. Sci. Transl. Med. 10, eaar5280 (2018).[3] Peng, C. et al. Cellular milieu imparts distinct pathological α- synuclein strains in α- synucleinopathies. Nature 557, 558–563 (2018).[4] Narasimhan, S. et al. Pathological tau strains from human brains recapitulate the diversity of tauopathies in nontransgenic mouse brain. J. Neurosci. 37, 11406–11423 (2017).编译作者：十级胖胖 (Brainnews创作团队)校审：Victoria, Simon (Brainnews编辑部)

责编 | 兮生物大分子间的相互作用，例如蛋白-蛋白以及蛋白-核酸相互作用，在各种生命过程中广泛存在，并起着重要的调控作用。发展大规模分析生物分子间相互作用的方法对生物学功能探索和疾病干预具有重要的意义。虽然亲和纯化和酵母双杂交等传统生化研究方法被广泛应用于发掘潜在的蛋白质相互作用，但它们都具有各自的缺点和局限性。2021年1月11日，来自斯坦福大学的化学生物学家Alice Ting教授在Nature Methods杂志上发表了题为“Deciphering molecular interactions by proximity labeling”的综述论文。该论文全面总结了邻近标记技术在生物大分子间相互作用中的广泛应用，并详细阐述了相关新方法的研究进展以及潜在的研究方向。该论文是由Ting实验室的博士后秦为，博士生Kelvin Cho，Peter Cavanagh与Alice Ting教授共同完成。邻近标记技术为研究蛋白质相互作用提供了一个与传统方法互补的选择。该技术依赖于具有邻近标记功能的工具酶，包括过氧化氢酶(e.g. APEX, HRP)和生物素连接酶(e.g. BioID, TurboID)等，在活细胞水平对邻近生物分子进行生物素标记。由于这些酶催化产生的高反应活性小分子具有很短的寿命，因此邻近标记技术具有较高的空间特异性。结合基于质谱的蛋白质组学技术和高通量测序技术，人们可以实现对邻近生物分子的大规模分析。邻近标记技术近年来在蛋白-蛋白相互作用领域已经获得了广泛的应用。通过基因编码将邻近标记工具酶与目标蛋白(t)融合， 可以实现对瞬时或者低亲和性相互作用蛋白的直接捕获。基于此，邻近标记技术成功实现了对动态信号转导通路，不可溶目标蛋白，酶-底物相互作用等研究难点的深度解析。另外，该技术也很快从活细胞水平拓展至活体水平，目前已经在细菌，酵母，果蝇，线虫，植物和小鼠等模式生物中得到了应用。与此同时，邻近标记技术也可以用于研究蛋白-RNA以及蛋白-DNA间的相互作用。例如，通过融合dCas9和邻近标记工具酶，我们可以分析基因组特定位置的结合蛋白。类似地，邻近标记工具酶与dCas13的结合可以实现对特定RNA的结合蛋白的标记和鉴定。综上所述，经过近十年来的发展，邻近标记技术已经逐渐获得了生物学家的青睐。通过发展更高效和更具时空分辨度的新方法，邻近标记技术有望在不久的将来解决更多更复杂的生物学问题。最后，关于邻近标记实验过程中的具体细节，感兴趣的朋友可以参考Ting实验室的Nature Protocols文章【1,2】以及课题组主页的视频讲座资料(https://www.tinglab.org/proximitylabeling-workshop-2020)。原文链接：https://www.nature.com/articles/s41592-020-01010-5

共同战疫 2020年 2019年底，一场疫病的浩劫从武汉开始，最终蔓延到全国，根据最新的疫情数据显示，目前确诊的新型冠状病毒感染者已经超过40000例，疑似病例也已经多于23000例，并且每天确诊的人数还在持续的增加。在这场无硝烟的疫病战争中，无数的医务人员与科研人员为之战斗，而解析新型冠状病毒的入侵机制，研发抗病毒药物以及病毒抑制剂是那么的急迫与重要。文献解析●1●新型冠状病毒（2019-CoV）属于Beta冠状病毒属（Betacoronavirus），其基因组序列与非典型肺炎冠状病毒(SARS-CoV)具有一定的同源性，在遗传进化上相近。那么，2019-CoV与“非典”SARS-CoV在致病机制上是否有某种相似？2003年发表在《Nature》题为“Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus”的论文揭示：SARS-CoV通过spike (S)蛋白与宿主细胞受体血管紧张素转化酶II（ACE-2）结合而侵入机体[1]。利用流式细胞实验与蛋白互作实验验证了ACE2与SARS-CoV S1之间的高度亲和力（a图验证了S1-Ig可特异识别ACE2蛋白；b图验证了可溶性的ACE2蛋白可阻断S1-Ig与细胞的结合；c图利用IP验证ACE2与S1蛋白的特异结合。来自文献：Li et al.,2003,Nature）●2●而针对新型冠状病毒，2020年1月21日，发表于中国生命科学类权威期刊《Science China Life Sciences》题为“Evolution of the novel coronavirus from the ongoing Wuhan outbreak and modeling of its spike protein for risk of human transmission”的文章中，作者将2019-CoV与 SARS-CoV的S-蛋白的宿主受体互作区（RBD区）进行了氨基酸比对分析，发现2019-CoV与MERS-CoV差异很大，与SARS-CoV比较相似。随后，作者利用分子结构模拟的方法，对2019-CoV的S蛋白和人ACE-2蛋白进行了结构互作研究，结果显示，尽管新型冠状病毒S-蛋白中与ACE-2蛋白结合的5个关键性氨基酸位点有4个发生了变化，但变化后的氨基酸却整体性上非常完美的维持了SARS病毒S蛋白与ACE-2蛋白互作的原结构构象。尽管新型冠状病毒的新结构与ACE-2蛋白互作能力，由于丢失的少数氢键有所下降，但仍达到很强的结合自由能（-50.6kcal/mol）[2]。这一结果说明新型冠状病毒也是通过病毒的S-蛋白与人ACE-2互作的分子机制来感染人的呼吸道上皮细胞。2019-CoV与SARS-CoV，MERS-Cov的RBD结构域序列比较及2019-CoV RBD结构域与ACE2蛋白互作结构模拟图（来自文献：Xu et al.,2020,SCIENCE CHINA Life Sciences）●3●随后，2020年1月26日，同济大学附属东方医院左为研究团队在预印本网站bioRxiv上发布了一项研究成果，通过分析新型冠状病毒的S-蛋白与人ACE-2的分子相互作用，从而进一步发现80% ACE-2受体主要聚集在II型肺泡细胞。左为教授说：“如果我们能人工合成ACE2蛋白，然后将它通过血管注入肺泡，理论上是可以“以假乱真”干扰病毒，或者开发抑制ACE-2的特异小分子干扰其功能，这都能起到保护肺细胞不被病毒侵扰”。左为教授提出的这种针对ACE-2的武汉新型冠状病毒的治疗方法是一种非常好的思路。而针对抑制ACE-2从而进一步抑制冠状病毒的复制方法，已经在SARS-CoV上得到了验证。2003年发表在《柳叶刀》上的文章“Treatment of SARS with human interferons”揭示了IFN可抑制SARS-CoV的复制[3,5]。同时有文献进一步解析了IFN-γ和IL-4可通过下调ACE-2的表达来抑制SARS-CoV[4]。随Interferon β浓度上升SARS-CoV复制受到抑制（来自文献：J Cinatl, et al.,2003,LACENT）Interferon-γ与IL-4抑制SARS-CoV病毒受体ACE2表达（来自文献：Lang, et al.,2006,VIROLOGY）产品推荐针对武汉新型冠状病毒，我们可以从ACE-2出发，而小优也为您提供了相关产品，希望给您科研思路提供最好的科研服务，以期待早日打赢这场没有硝烟的战争！中国加油！武汉加油！一：基于分子机理研究优宁维提供ACE-2的各种属的PCR 引物。关于基因调控方面， 优宁维还提供各种属基因沉默的siRNA，shRNA，过表达的ORF 和 cDNA，基因crispr相关产品。二：抗体三：重组蛋白四：小分子化合物五：相关检测试剂六：分子/蛋白互作（一）IP/CoIP相关产品（IP/WB的相关抗体小优在前面已经罗列啦，具体请见上文哟）（二）Biacore生物分子互作相关产品Biacore是生物分子相互作用领域的技术引领者和标准制定者。Biacore仪器常用于定性和定量检测蛋白与蛋白之间和蛋白与药物分子之间的相互作用，可提供的信息包括动力学，亲和力，特异性，热力学和浓度等等。相关产品如下：参考文献1.Li W, Moore MJ, Vasilieva N, et al. Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus.Nature. 2003 Nov 27;426(6965):450-4.2.Xu X, Chen P, Wang J,et al.Evolution of the novel coronavirus from the ongoing Wuhan outbreak and modeling of its spike protein for risk of human transmission.Sci China Life Sci. 2020 Jan 21. doi: 10.1007/s11427-020-1637-5.3.Cinatl J, Morgenstern B, Bauer G,et al.Treatment of SARS with human interferons.Lancet. 2003 Jul 26;362(9380):293-4.4.de Lang A, Osterhaus AD, Haagmans BL.Interferon-gamma and interleukin-4 downregulate expression of the SARS coronavirus receptor ACE2 in Vero E6 cells.Virology. 2006 Sep 30;353(2):474-81. Epub 2006 Jul 24.5.Haagmans BL, Kuiken T, Martina BE,et al. Pegylated interferon-alpha protects type 1 pneumocytes against SARS coronavirus infection in macaques.Nat Med. 2004 Mar;10(3):290-3. Epub 2004 Feb 22

来源：ChemicalBook背景[1-5]定量蛋白质组学服务是一种用于确定样品中蛋白质含量的分析化学技术服务。蛋白质鉴定的方法与一般（定性）蛋白质组学中使用的方法相同，但把量化作为附加维度。定量蛋白质组学不是仅仅提供在某个样品中鉴定的蛋白质列表，而是产生关于两个生物样品之间的生理差异的信息。例如，该方法可用于比较来自健康和患病患者的样品。定量蛋白质组学主要通过二维凝胶电泳进行（2-DE）或质谱（MS）。然而，最近开发的定量斑点印迹（QDB）分析方法能够以高通量形式测量样品中单个蛋白质的绝对量和相对量，从而为蛋白质组学研究开辟了新的方向。与需要MS进行下游蛋白质鉴定的2-DE相比，MS技术不仅可以识别蛋白种类还可以量化构成变化。胞内蛋白质组丰度的动态变化对各种生命过程有重要影响。例如在许多疾病的发生和发展进程中，常常伴随着某些蛋白质的表达异常。目前定量蛋白质组学技术主要分为标记(label)策略和非标记的(label free)定量策略，其中标记策略又分为体内标记(如SILAC、15N标记)，以及体外标记(如iTRAQ、TMT标记)。传统的基于2D双向凝胶电泳分离的蛋白质组通常可以鉴定出约1000种蛋白，对全蛋白质组的覆盖仅在5~10%左右，远远不能满足高通量定量蛋白质表达谱分析的要求。定量蛋白质组学服务结合精细的样品制备与超高分辨率、高灵敏度的液相色谱-质谱联用技术，可在细胞与组织类样品中鉴定直至超过10000个蛋白，对全蛋白质组的覆盖>60%。结合生物信息学分析，可以为客户构建高通量蛋白质定量表达谱。应用[6][7][8]1.生物医学应用定量蛋白质组学在医学领域具有独特的应用，特别是在药物和生物标志物发现领域。定量蛋白质组学可以标记不同蛋白质的复杂性质和定量分析，比更多传统方法（蛋白质印迹和ELISA）对蛋白质结构的差异以及翻译后修饰更敏感，因此可以量化对蛋白质的不同修饰。2.药物发现定量蛋白质组学在蛋白质靶标鉴定，蛋白质靶标验证和药物发现的毒性分析中具有重大作用。新药物的发现可被用于研究蛋白质-蛋白质相互作用，以及药物-小分子相互作用。因此，定量蛋白质组学在监测小药物样分子的副作用和理解一种药物靶标相对于另一种药物靶点的功效和治疗效果方面显示出巨大的作用。药物发现中绝对蛋白质定量的方法是LC-MS/MS和多反应监测（MRM）。3.单细胞蛋白质组学传统的质谱蛋白质组学已应用于数百万个细胞组成的大量样品。然而，这种群体平均测量对于异质样品（即人体组织或癌症）中单个细胞之间差异检测依然存在许都问题。SCoPE-MS可以量化单个哺乳动物细胞中的一千多种蛋白质，进一步的技术发展和想法可以显着提高单细胞蛋白质组学的灵敏度和通量。参考文献[1] Ong SE,Mann M(October 2005)."Mass spectrometry-based proteomics turns quantitative".Nature Chemical Biology.1(5):252–62.[2] Bantscheff M,Schirle M,Sweetman G,Rick J,Kuster B(October 2007)."Quantitative mass spectrometry in proteomics:a critical review".Analytical and Bioanalytical Chemistry.389(4):1017–31.[3] Nikolov M,Schmidt C,Urlaub H(2012).Quantitative mass spectrometry-based proteomics:an overview.Methods in Molecular Biology.893.pp.85–100.[4] Bantscheff M,Lemeer S,Savitski MM,Kuster B(September 2012)."Quantitative mass spectrometry in proteomics:critical review update from 2007 to the present".Analytical and Bioanalytical Chemistry.404(4):939–65.[5] "Quantitative targeted absolute proteomics-based ADME research as a new path to drug discovery and development:methodology,advantages,strategy,and prospects".Journal of Pharmaceutical Sciences.100(9):3547–59.[6] Rix U,Superti-Furga G(September 2009)."Target profiling of small molecules by chemical proteomics".Nature Chemical Biology.5(9):616–24.[7] Schenone M,Daník V,Wagner BK,Clemons PA(April 2013)."Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery".Nature Chemical Biology.9(4):232–40.[8] Budnik,Bogdan;Levy,Ezra;Slavov,Nikolai(2017-03-15)."Mass-spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity ring cell differentiation".bioRxiv 102681.

背景热休克蛋白90（Hsp90）是一种众所周知的依赖ATP的蛋白，可实现细胞在体内的平衡，Hsp90蛋白在癌细胞的生长和增殖中起着重要作用。此外，激酶水平还与Hsp90分子伴侣周期高度相关，这使Hsp90成为了抗癌治疗的靶标。但是，在Hsp90分子伴侣周期中，Hsp90抑制剂会与ATP口袋结合，最终阻止了ATP的水解，不可避免地损害了所有Hsp90。因此，现阶段研究表明单纯的抑制Hsp90或直接靶向Hsp90 ATPase结合位点可能不是实现癌症治疗的最佳选择。因此，我们必须找到新的策略或找到以前未知的结合位点从而实现抗癌效果。伴侣蛋白Cdc37负责将激酶募集到Hsp90，是Hsp90伴侣蛋白系统的一种靶向激酶的特定亚基，在结合开放状态的Hsp90之前，Cdc37可选择性地识别并结合未折叠的激酶蛋白。迄今为止，已经报道了Hsp90-Cdc37的两个晶体结构，但是精确的识别相互作用和潜在的小分子结合位点我们仍然不清楚。因此寻找与Hsp90-Cdc37的关键残基相互作用的特定小分子具有重要的意义。通过识别关键残基并选择性破坏Hsp90和Cdc37之间的相互作用可以精确阻断激酶客户的折叠，从而达到抗癌治疗的作用。到目前为止，还没有小分子与Hsp90或Cdc37特异性结合的报道，Science Advances杂志在线发表了中国药科大学尤启冬教授和上海交通大学张健教授课题组合作研发的Hsp90-Cdc37蛋白-蛋白相互作用的小分子抑制剂DDO-5936，该工作首次阐明Hsp90-Cdc37及特异性的小分子抑制剂的结构。通过对Hsp90-Cdc37结合界面有重大贡献的残基进行分子动力学（MD）模拟，并通过诱变进一步鉴定数据。结果表明，Hsp90上的E47和Q133与Cdc37上的R167之间相互作用，是Hsp90-Cdc37 PPI结合的决定因素。总而言之，这些结果表明DDO-5936的发现可能已经确定了Hsp90 N末端先前未知的结合位点，从而破坏了它与Cdc37的相互作用，通过对Hsp90及其伴侣分子周期的调控和对Hsp90-Cdc37的功能深刻的了解，Hsp90-Cdc37蛋白-蛋白相互作用可能成为一种新型且有效的癌症治疗靶标。图1.DDO-5936与Hsp90-Cdc37的相互作用机制图片来自ScienceAdvances分子动力学模拟蛋白-蛋白相互作用本研究首先通过长程的分子动力学模拟蛋白-蛋白相互作用过程中的动态变化，Hsp90-Cdc37复合物的结构均从蛋白质数据库（PDB）获得。从PDB获得了两种已知的复合物（PDB ID：1US7和2K5B），用于进一步分析。首先去除结晶水分子并使用TIP3P水分子将复合物溶剂化，将抗衡离子添加到了溶剂中。在执行MD之前，将整个系统分两步进行最小化。然后，将整个系统从0加热到300 K，最后，在恒定压力下使用50 ns的生产动态进行进一步分析，并以20 ps的间隔保存。接着计算Hsp90-Cdc37动态结合过程中的结合自由能并进一步分析单个氨基酸结合位点对其影响，得到了动态结合面中不同的氨基酸残基对结合贡献的大小。并在此结果的基础上，并通过对关键结合位点上突变蛋白的测试，验证了结合面上起到关键作用的氨基酸残基，并首次证明了Hsp90蛋白中的Glu47、Gln133与Cdc37蛋白中的Arg167形成的氢键作用网是Hsp90-Cdc37蛋白-蛋白相互作用的关键，其中任一氨基酸的突变会造成全部亲和力的丧失。因此，研究此关键相互作用所在的结合区域成为了抑制剂设计的重要基础。图2. DDO-5936与Hsp90-Cdc37 PPI界面上的关键残基结合图片来自ScienceAdvances图3. 关键氨基酸的突变对亲和力影响图片来自ScienceAdvance在深入地研究了Hsp90-Cdc37蛋白-蛋白相互作用表面的识别机制后，尤启冬教授等人基于前期实验结果，进一步开展了对抑制剂设计策略的筛选。从1500,000化合物商业库中筛选包含正电或碱性基团的化合物，过滤得到含有120,537个化合物的靶向库，然后通过分子对接特异性筛选可以靶向于关键相互作用网络的小分子，随后筛选其结合模式并计算其结合自由能，结合结构多样性，根据Hsp90-Cdc37复合物的晶体结构（PDB ID：2K5B和1US7），我们使用Hsp90上的关键残基（包括E47和Q133）来预测潜在的结合位点。然后，通过级联对接进行配体对接，包括标准精度对接，超精度对接和MM / GBSA评分。最终选择33个化合物进行测试，最后通过体外高通量筛选得到了先导化合物compound 11（21.1μM）。通过进一步的结构优化，得到了亲和力更高、结合模式明确、细胞内有效的Hsp90-Cdc37蛋白-蛋白相互作用调控剂DDO-5936，其体外亲和力达到低微摩尔级别。整个筛选流程如下：图4.通过筛选得到Ddo-5936抑制剂图片来自ScienceAdvances机制研究细胞内作用机制研究结果表明，DDO-5936阻断Hsp90-Cdc37相互作用后对激酶类蛋白的直接降解影响较小，影响较大的是阻滞其磷酸化的成熟过程，从而达到抗肿瘤细胞增殖的效果。进一步研究发现，DDO-5936具有较高的靶标特异性，显著抑制细胞周期，并在体内药效学研究中表现出了初步的有效性。总结绝大多数的蛋白酶需要Cdc37蛋白的协助完成Hsp伴侣循环最终实现成熟与释放，不同于以往与Hsp形成竞争关系的抑制剂，阻断Hsp与Cdc37的相互作用也是一种好的办法，这样不仅可以替换那些有毒副作用的抑制剂药物，也可以很好地阻断癌症的发生，起到治疗疾病的作用，此文章首次通过动力学模拟和结合自由能计算等方法阐明了此过程的机理并为新一代抑制剂的研究提供参考。本工作不仅为调控靶标Hsp90在肿瘤中的药物研发开辟了全新的思路，而且提供了优质的先导化合物，为阻断Hsp90-Cdc37蛋白-蛋白相互作用提供了重要的药理学证据和优质的小分子先导化合物 。参考文献：1. Wang L, Li L, Gu K, et al. Targeting Hsp90-Cdc37: A Promising Therapeutic Strategy by Inhibiting Hsp90 Chaperone Function. Current Drug Targets 2017;18:1572-85.2. Wang L, Li L, Zhou Z H, et al. Structure-based virtual screening and optimization of molators targeting Hsp90-Cdc37 interaction. Eur J Med Chem 2017;136:63-73.3. Verba K A, Wang R Y R, Arakawa A, et al. STRUCTURAL BIOLOGY Atomic structure of Hsp90-Cdc37-Cdk4 reveals that Hsp90 traps and stabilizes an unfolded kinase. Science 2016;352:1542-47. 相关文章Nature | 大牛是怎样从上亿化合物库中筛选到nM级化合物JMC | 意大利-美国联合团队虚拟筛选发现全新广谱抗菌拓扑异构酶抑制剂Nature Biotechnology | 46天!深度学习加速DDR1激酶抑制剂研发JMC | 200万化合物库中虚拟筛选发现抗肿瘤双靶点高选择性激酶抑制剂JMC | 如何针对高度保守的结合位点设计高选择性配体？N-肉豆蔻酰基转移酶的案例研究发现隐藏的变构位点作为变构——药物设计的新靶点应用高通量虚拟筛选加速先导化合物开发（一）：BTK研究案例应用高通量虚拟筛选加速先导化合物开发（二）：ROR γ t研究案例应用高通量虚拟筛选加速先导化合物开发（三）：HLA-DR研究案例虚拟筛选研究案例-CCL18拮抗剂阻断乳腺癌转移

011 蛋白质组学概念的提出早在18世纪，人类就发现了蛋白质这一类型的生物分子，然而直到1938年，瑞典化学家Jons Jakob Berzelius才明确提出了蛋白质的概念，指出蛋白质是由氨基酸组成的一类生物大分子。1949年，英国科学家Frederick Sanger首次测得了蛋白质牛胰岛素的氨基酸序列，并验证了蛋白质由氨基酸组成，他也凭借此项研究成果获得了1958年的诺贝尔化学奖。就在同一年，英国科学家Francis Crick首次提出分子生物学中心法则，这是20世纪生命科学领域最重要的发现之一 ：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）是生物体内遗传信息的载体，DNA以自身为复制模板，通过转录作用将遗传信息传递给核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），成熟的信使RNA（messenger RNA，mRNA）在核糖体上被翻译成一条长肽，然后经折叠加工形成具有生理活性的成熟蛋白。蛋白质是生命的物质基础，作为生物体活动功能的最终直接执行者，对生命活动的实现具有十分重要的作用，参与了生物体内几乎所有的生命活动过程。随着分子生物学技术的发展，蛋白质的诸多功能不断被研究和报道，如蛋白质可以作为离子通道参与信号转导等，人们愈发重视对蛋白质的研究。21世纪初，生命科学领域迎来了一个重要的里程碑——人类基因组草图的绘制完成。2001年由美国、英国、法国、德国、日本和中国科学家共同参与的人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）与Celera基因公司共同公布了人类基因组DNA序列草图，这也代表着人类在生命科学领域迈上了新台阶。2003年该计划的完成可以说是近半个世纪以来最激动人心的一项生命科学成就，它第一次揭示了人类的DNA序列信息，并提供了人类生命信息的蓝图。该研究成果分别发表在Nature、Science两大国际著名期刊上（Lander et al.，2001；Venter et al.，2001）。人类基因组计划因其破解人类遗传密码的里程碑式意义及对于遗传性疾病预防的潜在应用价值，与阿波罗登月计划、曼哈顿原子弹计划一起，并称为自然科学史上的三大计划。随着人类全基因组序列的破译和功能基因组学研究的展开，生命科学家越来越关注如何用基因组研究的模式开展蛋白质组学的研究。因此，Nature、Science在公布人类基因组草图的同时，分别发表了“And now for the proteome”和“Proteomics ingenomeland”的述评与展望（Abbott，2001；Fields，2001）。文中认为蛋白质组学将成为21世纪最大的战略资源，并将成为人类基因争夺战的战略制高点之一，这将蛋白质组学的地位提高到了前所未有的高度。事实上早在1994年，澳大利亚科学家Marc Wilkins便提出了蛋白质组（proteome）这一概念——表征基因组所能表达的全部蛋白。1997年，蛋白质组学（proteomics）的概念产生，其研究的主要内容是细胞、组织或器官内的全部蛋白质。此后该学科迅速发展，并得到了生命科学研究领域的重视。2001年，国际人类蛋白质组组织（Human Proteome Organization，HUPO）正式宣告成立，推动了蛋白质组学研究领域的发展。在2002年国际蛋白质组研讨会上，科学家明确提出了开展 “人类肝脏蛋白质组计划（Human Liver Proteome Project，HLPP）”的建议，并于2003年正式启动，至此人类蛋白质组计划的帷幕正式拉开。该项目也是我国科学家在生命科学领域领导的一次重大国际合作项目。蛋白质组学在细胞的增殖、分化、肿瘤形成等方面的研究中已经取得了不少成果和进展。尤其在癌症研究方面，已经鉴定到了一批肿瘤相关蛋白，这为相关疾病的早期诊断、蛋白质药物靶标的发现、治疗和预后提供了重要依据和线索。022 蛋白质组学的特点人类基因组序列的测定，标志着基因的研究迈上新台阶。随着基因测序技术的改进和成熟，人们对基因的研究更加便捷，对基因的认识也逐渐深入。目前认为可编码蛋白质的基因约20 000个。然而同一个基因可以表达出不同的信使RNA片段，而信使RNA在成熟过程中可能会出现剪切重组等，这显著增加了可表达蛋白的数目。同时，信使RNA翻译出的蛋白质会经历翻译后修饰（Berget，1995；Witze et al.，2007），实现对自身功能的调控，这进一步使蛋白质组的研究复杂化。此外，细胞内表达的蛋白质在时间和空间尺度上具有动态变化的性质，因此细胞内蛋白质的分析远比基因组的分析复杂和具有挑战性。基因组学的研究对象是DNA，DNA的性质较为稳定，且微量的目标样品可以通过PCR技术将其扩增，从而便于研究。目前DNA测序技术已较为成熟，且基因组学的数据库已相对完善，对于基因的研究已经进入了相对成熟的阶段。然而作为基因组后时代，蛋白质组目前尚处于探索和发展阶段。蛋白质组学研究的对象——蛋白质，其本身的性质不够稳定，可能同时存在多种不同的翻译后修饰类型，且其在不同细胞、组织内的表达丰度的动态范围较大。随着高分辨生物质谱技术的迅速发展及基于基因序列的蛋白质数据库的逐步完善，目前已可以实现对蛋白质氨基酸序列的测定，但是仍有大量的内容是未知的，包括蛋白质的定位、蛋白质与小分子的相互作用、蛋白质与蛋白质的相互作用、蛋白质的生命周期等。蛋白质组学的研究，可以从时间和空间角度对细胞、组织的蛋白质进行全面深入的研究，从而深入理解细胞如何利用蛋白质实现各种生理功能的调控。蛋白质组学亟待发展，研究技术也有待进一步发展和提升。033 生物质谱技术科学的进步往往带来技术的革新，而技术的革新会加速科学的发展。在蛋白质组学概念提出后的几年，由于受到研究技术的限制，发展十分缓慢。近些年，高分辨质谱技术（mass spectrometry，MS）的迅速发展，成为了蛋白质组学领域的核心技术。质谱技术是化学领域中研究化合物的一个重要手段。然而，直到软电离离子化技术的出现，才使得用质谱研究生物大分子成为了可能。2002年的诺贝尔化学奖授予美国科学家John Fenn和日本科学家Koichi Tanaka（“The Nobel Prize in Chemistry 2002”。Nobelprize.org. Nobel Media AB 2014. Web. 30 Apr 2015），以表彰他们在将软电离离子化方法用于生物大分子质谱分析方面所作出的贡献。John Fenn发明了电喷雾离子化方法（electrospray ionization，ESI）（Fenn et al.，1989）。样品在毛细管色谱柱中分离，经毛细管柱柱头流出时，在高压电场的作用下形成带电的小液滴。随着液滴的溶剂蒸发，液滴表面离子密度逐渐增大，当达到瑞利（Rayleigh）极限时，液滴发生破裂，形成更小的带电液滴。而后在电场作用下重复蒸发、分裂的过程，直至形成气相离子进入质谱，并被检测。该方法的优点在于可以实现从液态到气态分子的转变，产生的离子可以带有一个或多个电荷。Koichi Tanaka发明的基质辅助激光解析离子化技术（matrix-assisted laser desorption ionization，MALDI）利用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，从而使生物分子电离（Tanaka et al.，1988）。由于电喷雾离子化可形成单电荷离子及多电荷离子而有别于其他的MS离子化技术，并能实现高效液相与质谱的串联。特别是在1994年，Wilm和Mann发展了纳升级喷雾离子源（nano-electrospray ionization source，nanoESI source），与传统的ESI源（流速1～100 L/min）相比，该离子源可以采用更小的溶剂流速（10～500 nL/min），并且电喷雾更稳定，生成的带电液滴更小，能在室温条件下更好地实现去溶剂化（Wilm and Mann，1996），所以在目前的生物质谱中尤其是蛋白质组学研究领域，nanoESI离子化技术应用较为广泛。此外，对于质谱仪而言，质量分析器是其核心部件。随着分辨率和检测速率的提高，质谱仪在蛋白质组学研究中的优势逐渐凸显。目前已有的质量分析器的类型有 ：磁质谱、双聚焦质谱、离子回旋共振质谱、四极杆、四极杆离子阱质谱、时间飞行质谱、傅里叶变换质谱、三重四极杆质谱、线性离子阱质谱、静电轨道场离子回旋加速质谱（Orbitrap）等。其中，Orbitrap无疑是近20年质谱技术中最重要的发明。它极大地缩小了高分辨质量分析器的体积，维护更方便，使得高分辨质谱的台式化和易用化成为了可能，从而便于应用和推广。Thermo公司于2005年推出了第一台商业化的Orbitrap型质谱仪，其分辨率达到了100 000 （m/z 400），最大扫描速度为1.0 Hz。目前高效液相串联质谱在蛋白质和蛋白质的翻译后修饰的鉴定分析方面起着重要的作用，其原理是待测样品经高效液相色谱分离之后，经离子源的离子化，进入质谱。在质谱内通过特定的方式，将母离子碎裂产生碎片离子 ；进一步对碎片离子进行检测，得到该分析物的质谱检测图谱。随后对该图谱进行分析，通过与蛋白质数据库中的理论图谱比对，从而将其氨基酸序列信息和含有的修饰解析出来。质谱技术在生物大分子领域中的应用越来越广，包括定性和定量的高通量蛋白质分析，高通量的蛋白质翻译后修饰分析，鉴定蛋白质-蛋白质相互作用和调控网络，鉴定蛋白质和小分子的相互作用，生物标志物的鉴定和研究等。044 蛋白质组学的研究进展近20年来，蛋白质组学领域的研究技术在不断地革新和提高。1989年，电喷雾离子化技术发明，使得用质谱分析生物大分子成为可能；1993年，肽指纹图谱技术发明，推动了蛋白质鉴定技术的发展 ；1996年，利用二维凝胶电泳技术，实现了对酵母全蛋白的分析 ；2002年，细胞培养稳定同位素标记（stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC）技术发明，使得定量蛋白质组学研究迈上新台阶。1998年，中国启动了“人类肝脏蛋白质组计划”。2010年，中国团队完成肝脏蛋白质组的检测，共鉴定到6788个蛋白质，至此第一个人类器官的全蛋白质组检测工作得以完成（He，2005）。但由于当时的技术局限，所鉴定的蛋白质的数目还远远没有达到理论上肝脏全蛋白质组的蛋白数。近几年来，生物质谱技术进一步发展，其检测灵敏度和分辨率明显提高，扫描速度也有了显著提升，已经具备了高通量深度蛋白质组学研究的条件。因而，关于全蛋白质表达谱研究工作的报道越来越多。基于质谱的飞速发展，科研工作者目前已经对细胞内的不同细胞器做了组学研究，包括线粒体、高尔基体、细胞核等。蛋白质组学领域的知名科学家Matthias Mann在2008年报道了用一个月的时间鉴定了接近8000个蛋白质的成果（Hubner et al.，2008）。2011年，经过样品制备方法的创新、色谱分离方法的优化和质谱仪器的升级，Mann团队通过利用样品处理新方法FASP（flter-aided sample preparation）对小鼠的肝脏组织进行蛋白质组学研究，最终在21 d质谱数据采集时间内鉴定了高于10 000个蛋白质（Wisniewski et al.，2011），这是目前最具深度的蛋白质组学研究之一。随着质谱仪准确度、分辨率和扫描速度的不断提高，Mann实验室在2014年利用Q Exactive超高分辨率质谱仪，在4 d时间内定量分析了小鼠肝脏组织样本中的11 520个蛋白质（Azimifar et al.，2014）。因此随着样品制备方法、色谱分离方法及质谱仪器的不断优化和创新，科学家可以对生物体内的蛋白质进行更具深度的鉴定，从而更加深入地研究生命活动中的生理生化过程。2014年，国际著名杂志Nature子刊Nature Methods评述了近10年内的自然科学研究领域方法，基于质谱的蛋白质组学技术便是其中之一（Ten years of Methods，2014），可见质谱的发展对自然科学研究领域产生了极为重要的影响。当然，组学的研究并非仅仅是蛋白质测序，还包括了组学定量、靶向蛋白质组的研究等。其中靶向蛋白质组的研究被列入了Nature Methods 2012年度生命科学研究的方法学进展。2014年对于蛋白质组学的研究来说是具有里程碑意义的一年。4月，国际顶级期刊Nature首次报道了两篇关于接近完整的人类蛋白质组表达谱草图的文章。其中一篇文章收集了30种人类正常组织和细胞样本，包括成人和胎儿的组织及血液细胞，最终共鉴定到17 294个基因编码的蛋白，占总编码蛋白基因数的84%（Kim et al.，2014）。另外一篇文章，则综合了已发表的公共数据集及其实验室已有的数据，包括数十种人类组织、体液样本及细胞株等的鉴定分析结果，共鉴定到18 097个基因编码蛋白，占总编码蛋白基因数的92%（Wilhelm et al.，2014）。以上两篇文章共同绘制出了第一张人类蛋白质草图。近些年，中国蛋白质组学研究领域也在快速发展。2014年，“中国人蛋白质组草图计划”（CNHPP）这一科技部的重点项目正式展开，计划绘制包括心脏、肝脏、肺、肾脏等在内的10个最重要人体器官的蛋白质组生理和病理图谱，旨在以中国重大疾病的防治需求为牵引，发展蛋白质组研究相关设备及关键技术，构建中国人类蛋白质组的“百科全书”。055 蛋白质组学的应用通过基因组测序和分析，可以发现多种诱发癌症的驱动基因。2013年在Science杂志上发表了题为“Cancer genome landscape”的综述（Vogelstein et al.，2013），提出大部分癌症的发生是由于2～8个驱动基因突变，人体内目前认知到的癌症驱动基因共有约140个。尽管如此，驱动基因突变并不能解释所有癌症发生发展的现象。例如，2014年Nature杂志上发表的对230例肺腺癌临床样本的研究结果称，部分样本的基因组测序结果未能解释信号通路被激活的现象（The Cancer Genome Atlas Research Network，2014）。为了加深对癌症发生发展机制的认识，迫切需要对癌症进行深入的蛋白质组学研究，从而从蛋白质水平阐释癌症可能的发生发展机制。2006年年初，美国国立癌症研究院（National Cancer Institute，NCI）开始了一项为期5年，耗资1.04亿美元的临床蛋白质组肿瘤分析联盟（Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium，CPTAC）（Ellis et al.，2013），其目的在于建立应用于癌症诊断、治疗和预防的蛋白质组学技术，建立数据分析标准流程及试剂、参考物质的应用等系统，从而达到拓宽蛋白质组学技术在临床癌症诊断中的应用。目前该项目已经取得了非常出色的进展，其中一项工作为对被TCGA项目（The Cancer Genome Atlas）表征的95个结肠和直肠癌样本进行了深入的蛋白质组学及生物信息学分析，从蛋白质组学层面对结肠、直肠癌进行分型。在所得的5种蛋白质分型中，其中的两种与TCGA的一种转录本亚型——“微卫星不稳定亚型/CpG岛甲基化表型亚型”有重叠部分，但也发现了与之明显不同的基因突变、DNA甲基化和蛋白质表达图谱，这些都具有不同的临床表现，为临床疾病的研究提供了新的思路和检测指标（Zhang et al.，2014）。蛋白质组学在人类疾病中的研究应用已经在一些疾病中开展，如癌症、皮肤病、心脏病等。研究包括寻找与疾病相关的单个蛋白，整体研究某种疾病引起的蛋白质表达或修饰水平的变化，利用蛋白质组寻找一些致病微生物引起的疾病的诊断标记和疫苗等。随着精准医疗时代的到来，蛋白质组学在药物研究、临床诊断和个性化治疗等方面将具有更为广阔的应用前景。

记者 | 姜菁玲1根据美国每日科学网站的报道，加州大学河滨分校的科学家研发出了一种机器学习算法，通过测试药物的活性，从2亿多种化学物质中，筛选出了数百种新冠肺炎候选药物。该研究负责人、加州大学河滨分校教授安南达桑卡·雷解释说，这一药物发现平台是一种与人工智能有关的计算机算法，可通过反复试错学习预测药物的活性，其预测能力还能不断改进，“对于系统性发现治疗新冠肺炎新药而言，此类平台是重要的第一步”。在研究中，团队成员乔尔·科瓦列夫斯基用到了与新冠病毒蛋白相互作用的65种人类蛋白的配体，并为每种人类蛋白生成了机器学习模型，这些模型经过训练，可从其3D结构中识别出新配体。研究团队使用这些机器学习模型，从包含2亿种化学物质的数据库中筛选出了1000多万种小分子，并确定了能最有效靶向与新冠病毒蛋白相互作用的65种人类蛋白的化合物。他们从这些化合物中鉴定出了已经获得美国食品药品管理局（FDA）批准的化合物，例如一些药品和食品中使用的化合物。他们还使用机器学习模型计算了各种化合物的毒性，这有助于摒弃潜在的有毒候选物。科瓦列夫斯基表示，这65种蛋白质的靶标非常多样化，可能还可以帮助许多其他的疾病，例如癌症。研究人员表示，这种方法不仅使他们鉴定出对单个人类蛋白靶标具有最显著活性的候选药物，还发现了一些有望抑制两个或多个人类蛋白靶标的化学物。研究人员认为，传统依赖细胞培养测定的方法很昂贵，而且可能需要数年时间对药物进行测试，同时疾病本身变得越来越复杂。使用机器学习方法可以为研究人员提供进一步研究的机会，帮助他们从数据中寻找新的见解，在初步筛查大量化学物质方面他们的人工智能平台具有优势。除此之外，Ray和Kowalewski表示，虽然COVID-19大流行是他们研发的动力，但他们希望所做的对超过1000万种化学药品的活性预测，不仅能用于研发抗新冠肺炎药物，还能加速其他多种疾病药物的研发进程。目前项目研究者Ray正在寻找资金和合作者，以进行测试、动物实验以及临床试验。