蛋白互作研究方法

蛋白互作的研究背景内容比较丰富，我们分成两期定量蛋白质组学非标记定LabelFree定量蛋白质组学技术研究蛋白互作的背景进行介绍。本期我们接着说蛋白-蛋白互作方法的研究背景。蛋白互作方法的研究背景免疫印迹或免疫沉淀逐渐转向使用质谱法进行样本中的蛋白质定量，同时，也可使用该方法进行蛋白质鉴定。质谱法为高度复合的定量分析创造了条件，为它们的快速发展提供了条件，无需考虑费时的基于抗体的方法。LC-MS/MS还促进了研究人员对蛋白质异构体和翻译后修饰（PTMs）如何控制和调节多个细胞的了解。在蛋白质互作分析中，亲和纯化与多种定量质谱方法相结合非常常见。在本文中，我们将质谱采集策略分为“数据相关采集（DDA）”和“数据独立采集（DIA）”。目前为止，DDA最常见的用途是通过“鸟枪”技术鉴定化合物。在这些实验中，根据一组简单的启发式规则（通常是母离子强度）选择一个母离子进行碎片化，利用从所选母离子导出的MS/MS图谱进行蛋白质鉴定（图1）。相比之下，DIA并不是根据前体离子扫描中的信息来选择要进行碎片化的离子，而是在质谱仪可见范围内使整组前体离子碎片化，选择离子进行碎片化的方式区别对量化结果有重要影响。图1. QqTOF仪器中典型“鸟枪”实验的示意图。仪器在两种不同的扫描模式之间循环。（A） 在第一模式（MS1）中，所有离子都通过仪器传输，并在检测器处检测，随后可用于母离子测定。利用简单的规则（强度、电荷状态和离子是否已经碎裂）分析导出的质谱图。通过这些规则的离子随后被分离和碎片化。（B） 在MS/MS模式下，特定质量在第一个四极体中分离，在第二个四极体中碎片化。所有的碎片离子都被记录在分析仪中，并产生MS/MS图谱，用于鉴定化合物。质谱仪的不断创新使得检测灵敏度得到显著提高，可以检测样品中成分较少的物质。除了能够更深入地观察样品外，灵敏度的提高还可以提高仪器的扫描速度，这使得用不同的工作流程和方法进行定量和鉴定成为可能。本文我们讨论的是利用亲和纯化联合质谱技术（AP-MS）分析蛋白质-蛋白质相互作用时，肽和蛋白质的定量方法。这些方法也适用于涵盖需要量化的不同应用领域的各种其他类型样本，不过最终使用哪种方法还是由样本复杂性来决定。下期文章中，我们将切入主题，详细介绍几种目前常用的几种研究相互作用蛋白质组学的定量蛋白质组学非标记定量LabelFree法。本文由百泰派克生物科技整理编辑。百泰派克生物科技专注于基于质谱的蛋白质组学服务，结合亲和纯化与定量蛋白质组学非标记定量LabelFree、SILAC或SWATH定量技术，提供一系列定量蛋白质组研究策略，灵敏度高、重复性好，非常适合蛋白质相互作用的研究。文献参考：Stephen Tate, Brett Larsen, Ron Bonner, Anne-Claude Gingras, Label-free quantitative proteomics trends for protein-protein interactions. Journal of Proteomics, 2013.

为什么要研究蛋白质相互作用？蛋白质是细胞的功能分子，控制了细胞中所有生物系统。但是，通常它们不是“孤军奋战”，绝大多数蛋白质会与其他的蛋白质相互作用，一起参与生命的过程。因此了解未知或已知蛋白质的生物学功能和从细胞水平上确定细胞机制，已成为蛋白质组学研究的主要目标。 而当前研究蛋白质相互作用的主要技术方法，包括免疫共沉淀，荧光共定位，荧光双分子互补，荧光双分子互补，荧光能量共振转移等研究方法，通过了解各种研究方法的原理和特点，在实验中可根据不同的要求和目的选择合适的方法。免疫共沉淀(co-IP)原理是以抗原和抗体的特异性结合以及来自细菌的两种蛋白—Protein A/G—特异性结合抗体分子的现象为基础的研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在细胞内相互作用的有效方法。 人们将抗体和大质量的琼脂糖颗粒或者磁珠进行进行交联或者亲和，然后用这个带有抗体的大颗粒物去识别溶液中的目标蛋白，此时如果目标蛋白已经与其他蛋白相互作用形成复合体，那么含有目标蛋白的蛋白复合体就会被这些大质量的颗粒物所亲和，由于抗体锚定在了这些大质量的颗粒物上。 人们通过各种缓冲液的清洗除去非特异性的结合后的颗粒物可以通过离心或者磁力架吸引进行收集，此时结合在这些颗粒物上的蛋白质理论上就是可以和目标蛋白直接或者间接相互作用的蛋白了。 通常情况下，做实验前你对于这些可能的互作蛋白已经有了猜测，那么可以将大颗粒物拖拽下来的蛋白复合体跑 SDS-PAGE。 然后用 western-blot 的方法，可以用这些可能的互作蛋白的抗体去进行检测，就能验证这种蛋白质之间的相互作用了。根据实验目的的不同，免疫共沉淀的方法可以有很多可以修改的地方。 比如，如果你希望验证蛋白之间直接的相互作用，那么你可以选择体外翻译系统，在试管中合成需要验证互作的一对蛋白，然后混合孵育，并进行检测，也可以通过原核表达系统纯化这对蛋白，然后进行混合孵育并检测等等。免疫沉淀的方法运用合理，可以玩出很多有意思的实验，回答很多问题。 荧光共定位，Fluorescenceco-localization，在过去，这个技术一般用于细胞内辅助证明蛋白相互作用，前些年，如果是其他物种的蛋白质，你应用酵母双杂交系统验证了它们的相互作用，reviewer 可能会说你这个并不能反映原物种中的真实情况，可能是假阳性。 这个时候，一些研究者就将这两个蛋白分别与不同颜色的荧光蛋白融合表达于原物种细胞当中，在高分辨显微镜下，如果两种荧光出现在同一位置，那么就证明它们空间上较为接近，很有可能产生了相互作用。然而，就如上一句话里所说的，只是很有可能，并不能作为直接证据证明它们真的相互作用了。这个技术一般都是没办法时候的办法，就不举例子啦。 荧光双分子互补， bi-molecular fluorescence complementation(BiFC), 人们把绿色荧光蛋白 GFP 分子分割成两段，分别与接受测试的两个蛋白融合表达。如果两个蛋白相互作用，那么在细胞中 GFP 的两个片段就可以在空间上相互接近，并最终能够在激光的激发下发出绿色的荧光。 这里的 GFP 也可以换成萤火虫荧光素酶 Luciferase，原理相同，不同的是荧光素酶需要有底物的存在，发出的是自发荧光而非激发光 。这类技术的好处是可以再活细胞里进行观测，可以进行实时监控，定量等实验。 但是该技术的空间分辨率大概是 250nm，可以说对于蛋白质相互作用来说，依然是相当远的一个距离，因此也有很大可能是假阳性，同时融合蛋白也可能对受试蛋白的空间构象造成影响造成假阳性假阴性的结果。总的来说，这类技术还是要优于前两个的。 荧光能量共振转移，fluorescence resonance energy transfer(FRET)，这个技术与第三条又有所不同。 人们将目标蛋白 A 与青色荧光蛋白 CFP 融合表达，将 A 的可能的互作蛋白 B 与黄色荧光蛋白 YFP 融合表达，CFP 的激发光是波长是 414nm 紫外光区域，而荧光波长是 475nm 蓝光区域，恰好 YFP 的激发光是 475nm 附近蓝光区域，而荧光则是 525nm 附近黄色光区域。如果 AB 两蛋白相互作用，空间上相互接近，导致 CFP 和 YFP 分子也在空间上相互接近，那么当仅用紫外光激发 CFP 时，CFP 接收能量放出的蓝光将直接被 YFP 吸收，从而发出黄色的光，如果能够定量 CFP 的蓝光被转化成为 YFP 的黄光效率的变化，那么就可以检测出两个蛋白间的距离的变化 。 因此，这项技术不仅能验证蛋白质的相互作用，还能够表征这种相互作用距离的动态变化，比如蛋白质分子直接相对运动的方向速度等。比如在这篇文章里 ，作者们就用 FRET 测定了细胞运动时的受力情况。 亲和纯化 - 质谱，affinity purification-mass spectrometry(AP-MS)，刚才说了，如果你在实验之前已经对目标蛋白有推测的互作蛋白，那么你可以做 western-blot 对它进行检测。 可是，如果你想找一些以前未被报道，你自己也无法猜测的新互作蛋白呢？这个时候，你可以把免疫共沉淀后得到的样品，送去做蛋白组学质谱的实验室，通过质谱对这个复合体中的所有成员进行鉴定，理论上你就获得了整个目标蛋白复合体的成员信息。 如果说，之前的实验都是用一把枪，瞄准对面山头的敌人然后各个击破，那么质谱的方法就是拿了一门炮，将对面山头的敌人一网打尽。AP-MS 的方法还有很多变种。 比如利用一些可以对周围蛋白进行生物素标记的酶，我们可以将目标蛋白与这些酶融合表达，那么，在细胞内，这些融合蛋白就可以对目标蛋白附近的所有蛋白打上亲和素的标记，然后通过生物素与亲和素超强的亲和性，我们可以大幅提高 AP-MS 鉴定的灵敏度，在冲洗非特异性结合的时候，我们就不用担心弱相互作用被我们丢失，这类方法叫做邻近标记（proximity labeling）- 质谱法。 酵母双杂交，Yeasttwo hybrid（Y2H）, 这是一个古老的技术，Stanley Fields 和 Ok-KyuSong 在 1989 年的时候利用大肠杆菌中 GAL4 乳糖操纵子的原理，开发出这个方法用于检测蛋白质之间的相互作用 。 GAL4 操纵子有两个结构域，BD（binding domain）结构域和 AD（activation domain），其中 BD 结构域可以结合在 UAS（upstreamactivating sequence）DNA 区域，在 AD 结构域可以激活 UAS 下游的基因表达。 因此，他们把 GAL4 的两个结构域切分开，这样，BD 可以与目标蛋白结合，并且先行结合在报告基因 lacZ 上游的 UAS 区域，接着，把需要检验是否与目标蛋白相互作用的蛋白与 AD 结构域融合表达，如果目标蛋白和被检测蛋白可以相互作用，它们必定会在空间上相互接近彼此，这种相互作用可以使得 AD 和 BD 结构域也在空间上相互接近，这样就可以激活报告基因 lacZ 的表达，使得人们可以检测到 。 这个方法的优势在于廉价且易操作，这个方法一度非常流行，既可以用于筛选目标基因的相互作用蛋白，也可以用于验证相互作用，以及定量检测相互作用的强度。 但是缺点在于受试蛋白都需要和 AD/BD 结构域形成融合蛋白，空间构象可能改变，其次，许多蛋白质的相互作用可能同时需要其他蛋白的协助，而这个系统并无法把这些辅助蛋白也拉进来检测，因此经常漏掉很多的蛋白相互作用，第三，由于反应发生在真菌细胞内，如果你的目标蛋白来自其他物种，这个实验可能并不能反应蛋白在原物种细胞里的真实状态，最后，有的蛋白质可能自身就能够激活报告基因表达，比如转录因子，这样，这类蛋白就没办法通过酵母双杂交进行筛选和验证相互作用了（当然也可以将该蛋白换至 AD 载体上，但是依然有其局限性）。文章来源：每日生物评论欢迎关注微信公众号：每日生物评论，或Bio-review用最专业的精神，开放性的思维，与你一起探索行业走向，快速了解这个领域！

近日，中国科学院大连化学物理研究所研究员王方军团队在蛋白质复合物形成和干预机制分析新方法研究方面取得进展，通过溶液状态蛋白质赖氨酸两步稳定同位素标记和定量蛋白质组学分析，实现对蛋白—蛋白识别关键位点区域的精确探测，并可评估小分子对蛋白质复合物的构象识别干预情况。蛋白质的结构和相互作用决定了其生物学功能，目前对溶液状态蛋白—蛋白识别和结构动态变化研究仍然缺乏高灵敏度的分析方法。此前，研究团队发现蛋白质上赖氨酸的原位标记反应性与其所处微观结构中的氢键、静电相互作用强度密切相关；提出以蛋白质上所有赖氨酸位点为内源性反应探针，通过定量赖氨酸在蛋白—蛋白，蛋白—小分子结合前后的标记反应性变化，精确探测蛋白质识别过程中的关键区域。为进一步提高赖氨酸反应性定量分析的通量和灵敏度，该团队进一步发展了溶液状态蛋白质“活性—变性”赖氨酸两步稳定同位素标记定量策略（TILLRP），系统研究了重组SARS-CoV-2 S1蛋白质和人体ACE2受体之间的相互作用情况；发现S1蛋白质RBD Lys386-Lys462区域的赖氨酸位点在S1-ACE2复合物形成前后标记反应性发生了显著改变；提出可以利用该区域赖氨酸的标记反应性调控水平评估小分子活性物质对S1-ACE2识别的干预情况，可能有助于相关治疗药物分子的研发。该研究结果发表在《化学科学》（Chemical Science）上。上述研究工作得到国家自然科学基金、大连化物所创新基金等项目的资助。大连化物所提出蛋白质相互作用识别和干预机制分析新方法【来源：大连化学物理研究所】声明：转载此文是出于传递更多信息之目的。若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请作者持权属证明与本网联系，我们将及时更正、删除，谢谢。 邮箱地址：newmedia@xxcb.cn

近日，中国科学院大连化学物理研究所研究员王方军团队在蛋白质复合物形成和干预机制分析新方法研究方面取得新进展。研究人员通过溶液状态蛋白质赖氨酸两步稳定同位素标记和定量蛋白质组学分析，实现对蛋白—蛋白识别关键位点区域的精确探测，并可评估小分子对蛋白质复合物的构象识别干预情况。相关研究结果发表于《化学科学》。蛋白质的结构和相互作用决定了其生物学功能，目前对溶液状态蛋白—蛋白识别和结构动态变化研究仍然缺乏高灵敏度的分析方法。此前，王方军等人发现蛋白质上赖氨酸的原位标记反应性与其所处微观结构中的氢键、静电相互作用强度密切相关。受此启发，研究团队又提出以蛋白质上所有赖氨酸位点为内源性反应探针，通过定量赖氨酸侧链氨基在蛋白—蛋白、蛋白—小分子结合前后的标记反应性变化，精确探测蛋白质识别过程中的关键区域和相关构象变化。为进一步提高赖氨酸反应性定量分析的通量和灵敏度，该研究进一步发展了溶液状态蛋白质 " 活性—变性 " 赖氨酸两步稳定同位素标记定量策略（TILLRP），系统研究了重组 SARS-CoV-2 S1 蛋白质和人体 ACE2 受体之间的相互作用情况；发现 S1 蛋白质 RBD Lys386-Lys462 区域的赖氨酸位点在 S1-ACE2 复合物形成前后标记反应性发生了显著改变，并由此提出可以利用该区域赖氨酸的标记反应性调控水平评估小分子活性物质对 S1-ACE2 识别的干预情况。该研究成果可能有助于相关治疗药物分子的研发。相关论文信息：https://doi.org/10.1039/D0SC05330A【来源：科普中国网】声明：转载此文是出于传递更多信息之目的。若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请作者持权属证明与本网联系，我们将及时更正、删除，谢谢。 邮箱地址：newmedia@xxcb.cn

近日，中国科学院上海药物研究所陈小华课题组和中国科学院成都生物研究所唐卓课题组合作，基于开发新的非天然氨基酸，发展了一种能够在活细胞中捕捉蛋白质相互作用的新技术，该方法兼具时空可分辨和交联位点选择性的优势。研究成果“Genetically Encoded Resie-Selective Photo-Crosslinker to Capture Protein-Protein Interactions in Living Cells”在线发表于Cell出版社子刊Chem 杂志。蛋白质相互作用在生命活动中扮演非常重要的角色，发现蛋白质新的相互作用或功能将有助于阐明特定生命过程，为相关疾病的治疗提供理论基础。然而蛋白质相互作用网络十分复杂，在活体条件下开展蛋白质相互作用研究非常具有挑战性。基于基因密码子拓展技术，在活体细胞的目标蛋白质中定点引入具有共价交联活性的非天然氨基酸，已经成为活细胞内研究蛋白质-蛋白质相互作用的有力工具。研究团队针对现有非选择性的蛋白质交联技术产生的交联肽段结构复杂、质谱数据难以解析、假阳性高等关键问题，发展了一种时空可分辨的残基选择性(resie-selective)共价交联新方法，成功实现了在活细胞中对相互作用的蛋白质复合物的有效捕捉及后续质谱的分析。通过对多种相互作用蛋白质（如乙酰化酶与底物）的研究，该技术可以捕捉活细胞中微弱的蛋白质相互作用；其获得蛋白质的交联肽段可以很大程度上简化质谱的分析、作为确定蛋白质相互作用的直接证据、确定相互作用的界面以及验证酶与特定底物的相互作用。该方法在一定程度上突破了传统蛋白质相互作用分析、发现方法的瓶颈，有望被广泛用于传统方法难以发现的活细胞中微弱的、瞬间的或呈动态作用方式的蛋白相互作用的研究。陈小华、唐卓为论文的共同通讯作者，陈小华课题组胡伟为该论文第一作者；上海药物所谭敏佳课题组参与此项工作。该研究得到上海药物所质谱技术服务部的支持，该项目得到国家自然科学基金委、中科院、上海市科委项目的资助。具有时空可分辨的捕捉活细胞中蛋白质相互作用技术示意图中国生物技术网诚邀生物领域科学家在我们的平台上，发表和介绍国内外原创的科研成果。注：国内为原创研究成果或评论、综述，国际为在线发表一个月内的最新成果或综述，字数500字以上，并请提供至少一张图片。投稿者，请将文章发送至weixin@im.ac.cn。近期热文直接点击文字即可浏览！1、补牙或将成为历史？2、科学你慢慢学，中医我先治病去了3、科学告诉你应该多久洗一次澡4、新证据：喝咖啡能延长寿命！5、据说，这是生物医学硕士博士生的真实的生活写照6、一顿早餐到底有多重要？7、情商也是把双刃剑！高情商或让你更脆弱8、施一公：压死骆驼的最后一根稻草，是鼓励科学家创业！9、“科学禁食法”真能降低重大疾病风险10、睡眠科学家揭示出8种睡好觉的秘诀11、有志者事竟成！2型糖尿病成功被逆转12、每周两半小时，任何形式的锻炼都可以使你更长寿13、喝醉以后，你以为睡一觉就没事儿了？！14、仰卧起坐等或将成为延寿运动？15、冥想、瑜伽、太极等不仅能够改善身心健康...

随着生物科技的迅速发展，每天都会有海量的生物学数据产生，如何有效的分析这些“生物学大数据”？生物信息学的应用变得尤为重要，在生物领域从基因测序，到基因编辑，再到基因疗法的精准医疗，由生物科技引发的又一场变革正悄然而至。试问大家做好准备迎接它到来了吗？本次分享的主题为：如何快速获取海量数据？我们就从物种的DNA或蛋白质序列说起，在我们的科学研究中下载序列是一件简单不过的事情，无非就是联网NCBI等主页上，选择数据库后输入AC号或GI号后直接下载。如果是少量的序列数据，我们可以通过一个个ID去查找，复制，粘贴方式保存到本地文件中。但是如何大批量下载数据呢？再通过复制、粘贴方法虽然很精确但是对于大批量的数据下载效率实在是太低了。是否可以直接下载数据库准备好的序列文件？或者编写程序脚本进行批量下载？本次小鹿分享的是2种热门物种（人和鼠）的无编程基础的下载方式。（我们后面会分享“如何使用代码批量下载生物学序列数据”） 物种 人 1.NCBI的GenBank数据库基因：MYH9物种：人Homo sapiens（1）用浏览器登录NCBI数据库官网：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/（2）数据库选择框：选择Gene；在搜索框输入：MYH9，可以添加Homo sapiens或者Human，这样匹配更准确；（3）点击MYH9 - myosin heavy chain 9，选择FASTA格式；（4）点击下载MYH9基因序列NCBI Reference Sequence: NC_000022.11，起个合适的文件名，推荐使用基因名或者数据库登录号；（5）物种基因组和蛋白组序列的下载选择Genome子数据库，同样在搜索框输入物种英文名或拉丁学名，例如，输入human，我们查找人的基因组数据，如下所示：点击下载基因组或蛋白组FASTA序列，直接会弹出下载链接，选择保存文件的位置即可开始下载；还可以下载NCBI上的基因组注释GFF文件（Ensembl数据库也可以下载物种的GFF文件，后面会给大家讲到）物种 人和小鼠 2.Uniprot数据库样例蛋白：P35579物种：人Homo sapiens和小鼠Mus musculus（1）用浏览器登录Uniprot数据库官网：https://www.uniprot.org/（2）搜索框输入：P35579，点击Search；（3）查看P35579蛋白的生物学信息：肌球蛋白9（Myosin-9）；可以看到该蛋白主要分布在细胞基质中，是细胞的动力蛋白；（4）下载序列数据，点击FASTA；（5）下载物种蛋白质组序列文件（例如下载物种：小鼠mus musculus）；在Uniprot数据库官网选择Proteomes子库，然后在搜索框输入：mus musculus，选择Organism ID为10090的小鼠；点击Protein Count: 55462，显示小鼠蛋白Entry，可以根据需要定制自己需要的数据：例如，我们需要GeneID，点击Columns进行个性化的定制；如下所示：点击Download下载所需要的数据，选择文件格式。如果我们需要的是表格数据，我们通常下载为Tab分割符（Tab-separated）的txt文件，因为Excel表格有最大行数的限制，如果超出最大行数会导致数据丢失；如果是序列文件，我们选择下载FASTA格式的文件；物种 人 3.Ensembl(Ensembl Genome Browser）数据库物种：人Homo sapiens（1）使用浏览器登录数据数据库：https://asia.ensembl.org/index.html（2）选择Human数据库，如下所示：（3）选择下载基因组序列，见下图：（4）在Ensembl数据库下载物种的GFF文件前面我们讲到了在NCBI数据库中下载物种基因组注释GFF文件，其实我们还可以在Ensembl数据库中下载物种的注释文件，而且在Ensembl中下载的GFF文件更加标准，使用起来更方便。（5）直接连接到ensembl的FTP服务器，网址：ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-100/fasta/homo_sapiens/dna/选择toplevel标签的序列文件进行下载，如下所示：小鹿后面还会分享“如何使用代码批量下载生物学序列数据”哦，请关注鹿明生物，get最新分享热文。 猜你还想看◆生信分析：你可以更美一些：SnapGene Viewer软件序列可视化操作◆云平台：震惊！他花了3分钟就完成了我三个周的工作!◆云平台：欧易/鹿明云 | 免费的聚类热图不试试吗？◆生信分析：这个R包不太冷系列——GOplot（功能富集绘图）◆生信分析：10行代码让你的相关性图貌美如花◆生信分析：对话百年名画--文章绘图配色高级又简单！◆生信分析：只需3分钟Get“代谢通路分析神器”◆生信分析：玩转生信—火山图中“亿点细节”，你会打造吗？◆生信分析：【指南】Cytoscape之stringAPP蛋白互作分析详解◆生信分析：【教程】组学研究，用python快速实现PCA分析和绘图◆生信分析：组学研究，R语言实用技巧—热图，运用pheatmap包简单易懂快速汇图方法来袭~◆生信分析：【情人节】R语言—小提琴图的浪漫邂逅END文章来源于鹿明生物

10月28日，记者从中国科学院青岛生物能源与过程研究所获悉，该所代谢物组学研究组冯银刚研究员带领的研究团队在能源微生物的一对相互作用蛋白质模块中发现了一种独特的pH依赖的双结合位点切换现象，并阐明了其化学和结构机制，相关成果近日发表于国际高影响刊物《科学进展》（Science Advances）。该研究不仅揭示了生物体系复杂精巧的调控机制，同时也为pH依赖的蛋白质器件和生物材料开发提供了新的素材，在合成生物学和生物技术应用中具有重要价值。pH是几乎所有在水溶液中进行的化学反应的重要因素，在生命过程中具有重要的作用。生物体中有许多pH依赖的蛋白质功能开关，不仅可调控细胞的生理和生化过程，而且可作为生物技术开发中的关键感应器件和功能开关。目前已知的pH依赖的蛋白质构象变化都是通过感应pH变化实现“打开-关闭”式的开关切换控制，发现新型的pH依赖的蛋白质互作方式具有重要的科学应用价值。代谢物组学研究组长期以来以一种高效降解木质纤维素的多酶复合体“纤维小体”为对象开展研究，并在研究一种产溶剂梭菌——丙酮丁醇梭菌——的纤维小体时，发现了一种全新的pH依赖的蛋白质相互作用变化方式。研究人员通过核磁共振技术发现该细菌中的一对纤维小体组装模块——粘连模块和对接模块——在低pH条件下会选择性结合于一个位点，而在高pH条件下选择性结合于另一个位点，从而形成了在不同pH条件下两个相互作用位点之间的切换（图1）。随后，研究人员利用核磁共振、X射线晶体学、微量热、分子动力学模拟等多种生物物理技术，揭示了这两个蛋白模块相互作用在pH依赖性方面的化学和结构机制：对接模块上两个结合位点的多对不对称残基，以及粘连模块上结合位点处的一段富含负电的柔性区残基的pKa漂移共同造成了这对蛋白模块相互作用的pH依赖的位点切换现象。这种精巧的pH依赖的蛋白质互作模式不同于其他已知的pH依赖性蛋白质互作方式，不仅揭示了生命体中可能存在的复杂分子作用机制，而且为生物材料开发、蛋白质感应器件设计、合成生物学元件设计等多种生物技术应用提供了崭新的素材和方案。据介绍，该代谢物组学研究组长期致力于木质纤维素降解利用和生物质燃料开发，在高效降解木质纤维素的分子机器“纤维小体”研究中取得了多项重要的研究成果，在高温厌氧菌的遗传改造、代谢工程和合成生物学开发方面，形成了独具特色的研究方向和国际领先的技术优势。该论文所报道的研究成果是代谢物组学研究组长期坚持在木质纤维素降解利用和“纤维小体”研究中取得的重要成果。代谢物组学研究组博士生姚形哲、助理研究员陈超、蛋白质设计研究组副研究员王业飞是本论文的共同第一作者，代谢物组学研究组冯银刚研究员为本论文的通讯作者。该工作得到了国家自然科学基金委、中科院以及以色列科学基金会的资助。图1. pH依赖的蛋白质相互作用位点切换。A. 不同pH条件下通过核磁共振观测到的不同的相互作用位点。B. 两种结合方式的复合物晶体结构。C. pH依赖的结合位点切换机制的卡通模型。该模型中蓝色为粘连模块，黄色/绿色为一个对接模块上的两个部分对称的结合位点。来源：科技日报

责编 | 兮G 蛋白偶联受体(GPCRs)是最大的一类膜蛋白家族受体，通过偶联下游异源三聚体G蛋白将信号从胞外传递至胞内。GPCR是人类基因组编码最大的膜蛋白超家族，也是最大的药物靶点。异源三聚体G蛋白主要有四个家族： Gi/o, Gs, Gq/11, G12/13, 它们所介导和调控的细胞质信号级联反应在哺乳动物细胞功能的各个方面都起着非常关键的作用【1-3】。研究发现，单个GPCR可以同时激活一个以上的G蛋白家族，并且具有不同的效率。表现出最高的效率和最快的动力学特性的称为“初级偶联”，而表现出较低的效率或较慢的动力学特性的则称为“次级偶联”。这一现象使得GPCR介导的细胞信号转导更加复杂。近年来，随着冷冻电镜技术的发展，许多GPCRs及其下游G蛋白复合物的结构得以解析，为人们在分子水平理解GPCRs与G蛋白的互作提供了重要的结构信息，揭示了G蛋白主要是通过Gα亚基的C-末端与受体跨膜核心区域结合【4-6】。然而，这些结构未能清楚地阐明初级和次级偶联观察到的不同偶联效率的结构机理。2020年6月22日，香港中文大学（深圳）杜洋与韩国成均馆大学KaYoung Chung在Nature Communications上发表了题为“Structural mechanism underlying primary and secondary coupling between GPCRs and the Gi/o family”的研究成果。研究发现，G蛋白α亚基 C-末端与受体的结合对于区分初级和次级Gi/o偶联起到关键作用；此外，研究还发现受体第二个胞内环上的一个保守疏水残基对初级Gi/o-偶联并不是至关重要的； 然而，它可能对于次级Gi/o偶联非常重要。本研究中，作者分别利用M2 毒蕈碱受体（M2R）和β2肾上腺素受体（β2AR）作为研究初级Gi/o偶联和次级Gi/o偶联的模式受体，通过氢氘交换质谱（hydrogen deuterium exchange mass spectrometry, HDX-MS）的方法，研究两种模式受体与下游Gi/o蛋白的动态组装过程。研究者首先分析了Gi/o蛋白的氢氘交换变化，发现当Gi/o蛋白与初级偶联受体M2R反应时，可以检测到在G蛋白C-末端的氢氘交换水平会明显降低，表明Gi/o蛋白C-末端与M2R发生稳定的结合。然而，当Gi/o蛋白与次级偶联受体β2AR反应时，Gi/o 大部分区域的氢氘交换变化与M2R 反应类似，但是其C-末端的氢氘交换没有发生明显变化，这一现象表明Gi/o蛋白与β2AR相互作用时，其C-末端可能没有形成稳定的α螺旋或者没有深入的插到受体的跨膜核心区域（图1）。进一步的脉冲氢氘交换质谱（pulsed HDX-MS）实验 （即在不同的时间尺度上观察Gi/o蛋白与受体互作时各个区域的氢氘交换变）也验证了这一结果。图1 G 蛋白与分别与M2R和β2AR结合时Gα 的氢氘交换水平变化随后作者截短了 Gi/o蛋白C-末端的最后5个与受体互作的5个氨基酸，功能实验发现这些截短可以显著降低Gi/o蛋白与初级偶联受体M2R偶联的效率，然而并没有使其完全丧失功能，而是使其效率和次级偶联受体相当。有意思的是，这些截短对于Gi/o蛋白与次级偶联受体β2AR偶联的效率并没有显著影响。这些结果表明Gi/o蛋白C-末端的5个氨基酸对于区分G初级偶联和次级偶联发挥了重要作用。之前的结构和功能研究揭示GPCRs 第二个胞内环上的一个保守氨基酸在与G蛋白互作过程中发挥关键作用。研究者进一步分析了这一保守氨基酸对于初级偶联和次级偶联是否有发挥不同作用。通过突变和功能实验以及一系列的序列分析，研究者发现该保守氨基酸在次级Gi/o 偶联中发挥关键作用，然而对于初级Gi/o偶联的作用并不是至关重要。图2 GPCRs 与Gs、Gi/o初级偶联以及Gi/o 次级偶联机制示意图这项工作利用氢氘交换质谱等方法，在已有的结构基础上对GPCRs与Gi/o蛋白的初级和次级偶联进行了深入的分析，揭示了受体偶联Gi/o蛋白产生不同效率可能的分子机制。同时，对比先前β2AR与Gs蛋白的氢氘交换实验数据7，该研究还发现GPCR与Gi/o的偶联可能遵循某种与Gs蛋白不同的机制，这种差异可能为理解GPCR-G蛋白选择性提供更多线索，还需要进一步深入的研究。这是继两人在2019年在Cell期刊（详见BioArt报道：专家点评| Brian Kobilka等两篇Cell揭示GPCR-G蛋白的时序组装），利用氢氘交换质谱等生物物理技术研究GPCR偶联构象动态性又取得的重要进展，进一步的合作研究正在顺利进行中。

瑞典Attana公司制造的生物大分子相互作用检测设备——Attana Cell 200蛋白互作分析仪，是一种无需标记、可直接在细胞表面测量分子相互作用的生物传感器，其填补了传统生物传感器与基于细胞的分析方法之间的空白。Attana蛋白互作分析仪依托于石英晶体微天平（Quartz Crystal Microbalance，简称QCM）技术，外加的交流电势使石英晶体在共振频率下震动，当分子流经晶体并与表面结合，振动频率会发生变化，其频率差异可以用来反映实时的分子相互作用。自2010年上市以来，Attana Cell 200蛋白互作分析仪已广泛用于蛋白互作、蛋白细胞互作、抗体药研发等领域，赢得了包括大学、药企、CRO实验室的信任，与制药化工巨头Lonza集团、胰岛素研发明星诺和诺德等长期合作。相比传统生物大分子相互作用检测技术，Attana开创了直接在细胞层面进行实时原位分子结合动力学的检测方法，更准确地反映了体内环境的分子间互作，能够高质量、精确地研究其特异性、动力学和亲和力。Attana Cell 200蛋白互作分析仪检测特点1、可检测蛋白与细胞的相互作用2、可检测蛋白与组织切片的相互作用3、可检测细胞与细胞的相互作用4、可使用粗制蛋白样品Attana蛋白互作分析仪应用实例用QCM技术检测蛋白药物与肿瘤组织切片的结合动力学长久以来，将癌症组织用甲醛固定石蜡包埋（FFPE）后做组织切片，进行免疫组化（IHC）分析，是癌症相关抗原的标准检测方法。但免疫组化本身很难定量抗体与癌症相关抗原结合的特异性和亲和力。Clausen等人建立了一套以Attana Cell 200 QCM技术为核心，直接在组织切片上进行实时原位分子结合动力学的检测方法。研究者直接在FFPE人胎盘组织、乳腺癌和前列腺肿瘤标本中，测定了rVAR2蛋白与它的胎盘样硫酸软骨素（pl-CS）受体之间的相互作用，发现rVAR2与FFPE人胎盘、肿瘤组织存在纳摩尔级的亲和力，与pl-CS阴性的正常组织无相互作用。进一步用雄激素受体N-20的抗体（抗AR）对此方法进行评估，发现Attana得出的KD值与可用抗原表位的数量无关，表明Attana不仅能在组织标本上直接对抗原-抗体结合亲和力进行定量，还能评估抗体所能识别的抗原表位的数量。基于这些结果，研究者认为Attana QCM技术不仅可用于挑选诊断和治疗中的最佳生物制剂，还能用于开发新型高亲和力的药物。（Clausen, T. M., et al. Real-time and label free determination of ligand binding-kinetics to primary cancer tissue specimens; a novel tool for the assessment of biomarker targeting. Sens Biosensing Res. 2016; 9: 23-30.）图1.Attana Cell 200蛋白互作分析仪与COP-1检测芯片。图2.免疫组化鉴定为阳性的甲醛固定石蜡包埋组织样品被切成5μm厚的薄片，并固定在COP-1芯片中心。 图3.（b）Attana测定出rVAR2蛋白与胎盘组织的KD值为4.27nM，具有高亲和力。（c）当添加了能抑制rVAR2粘附于胎盘组织的CSA溶液后，rVAR2蛋白与胎盘组织的结合曲线不再有明显的结合点和解离点。图4.（a）免疫组化结果显示，与作为正常组织对照的扁桃体组织切片相比，rVAR2蛋白与乳腺癌、前列腺肿瘤组织切片有强相互作用，进一步用Attana测定其KD值分别为8.9nM和6.65nM，而与扁桃体组织的结合曲线无明显的结合点和解离点，无法测出其KD值。（b和c）用V5-FITC的抗体对rVAR2蛋白进行定位，进一步验证了Attana得到的结果，即rVAR2蛋白与前列腺肿瘤组织切片强结合，而不与扁桃体组织结合。证明Attana能准确对组织切片上抗原-抗体的亲和力进行定性和定量。图5.检测发现纯化的胎盘样硫酸软骨素（pl-CS）受体与rVAR2蛋白的KD值为3.6nM，具有强结合，证明Attana可准确检测纯化蛋白间的相互作用。图6.将乳腺癌细胞(SKBR3)、前列腺癌细胞(LNCap)与中国仓鼠卵巢细胞（CHO）相比，免疫组化和Attana的结果一致，乳腺癌细胞与前列腺癌细胞均检测到细胞与rVAR2蛋白有着很强的亲和力。图7.高表达AR的Lncap细胞与AR抗体有强的亲和力，而雄激素非依赖的PC3与AR抗体的亲和力相对较弱。这一结果进一步在细胞水平上证明了Attana具有广泛的兼容性。图8.采用Attana对AR抗体与FFPE组织切片的亲和力检测结果，与免疫组化结果一致，即免疫组化阳性的FFPE前列腺癌组织，对AR抗体有强的亲和力，免疫组化阴性的FFPE胎盘组织，对AR抗体无相互作用。这一结果在组织切片水平上也证明了Attana能有效监测抗体与切片的结合。实验关键步骤总结：1、组织切片如何固定在COP-1芯片上Attana的COP-1芯片在室温用聚L-赖氨酸溶液包被5分钟。包被后，用PBST冲洗芯片，并在室温干燥2小时。将甲醛固定石蜡包埋（FFPE）组织样品切成5μm厚的薄片，并贴在芯片上，60℃烘烤1h。2、脱蜡和抗原修复将COP-1芯片上的组织样品浸没在EZprep溶液中，65℃水浴30min进行脱蜡。之后PBS洗3次。再在95℃下，用pH6.0的10mM柠檬酸钠、0.05％吐温溶液浸泡30min进行抗原修复。