代谢组学基本研究流程

我们知道随着代谢组学的不断发展，对代谢物定性定量准确性不断提高，代谢组学在医药学领域的应用越来越广泛。小鹿特地总结了代谢组学在医药领域的主要应用方向（机制研究、标志物筛选和药效评价）及其对应的实验设计思路（见下图）。看完这个设计方案是不是眼前一亮那小鹿就先跟您说一说，医学代谢组学中的机制研究最热门的技术方式吧~~案例一多组学联合：基因组、转录组、蛋白组、代谢组、单细胞测序案例来源：《Journal of Hepatology》 2020, IF=20.58 （López-Vicario et al. J Hepatol.，2020; S0168-8278(20)30208-7. doi: 10.1016/j.jhep.2020.03.046.）原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32294533/研究目的：研究肝癌的瘤内异质性样本来源：8个病人的42个样本（医院手术样本）+298个HCC样本（购买组织芯片）研究手段：利用5种组学技术（基因组、转录组、蛋白组、代谢组、单细胞测序）研究细胞与细胞、亚克隆与亚克隆、病变体与病变体、病人与病人之间的肿瘤异质性使用技术：基因组、转录组、蛋白组、LC-MS非靶向代谢组、单细胞测序、免疫组化、定量PCR实验设计和关键结论展示图 | 实验设计和分析流程结论1：所有病变体的免疫细胞单细胞测序和聚类分析表明：肝癌（HCC）可以分为三个亚型结论2：不同HCC亚型的TCA循环，糖酵解，尿素循环以及核苷合成途径等代谢特征是不同的结论3：用含有298个HCC样本的组织芯片进行免疫组化分析，对HCC分子分型的合理性进行验证，结果发现HCC不同亚型的免疫标志物CD45 和 Foxp3的表达具有明显差异，且与患者生存期具有显著相关性，因此免疫标志物CD45 和 Foxp3可以作为HCC的预后标志物小鹿简评本文先利用几十个样本的多组学联合分析，全面研究HCC的异质性，并将HCC划分为三个亚型，每个亚型都有自己独特的代谢特征，随后利用大样本的HCC组织芯片对不同亚型的免疫标志物CD45 和 Foxp3的表达情况进行研究，发现不同亚型的免疫标志物CD45 和 Foxp3的表达具有明显差异，且与患者生存期具有显著相关性。肝癌肿瘤异质性是导致肝癌化疗失败的重要原因之一，更为精细的分子分型有助于治疗方案的选择和预测预后效果，具有很好的临床意义，这也是本文能发表在《Gut》上的重要原因。小鹿物语利用科学技术解决临床的实际问题是医生和科研工作者的共同责任，但目前的大环境下专职科研工作者不上临床，只低头做基础研究，并不了解临床上需要解决的问题，相反临床医生十分了解临床上的一些待解决的问题，但由于医务工作繁忙而无暇科研。因此，专职科研工作者与临床医生的沟通与合作，对于选择好的研究切入点十分重要。毕竟科学技术手段大部分是相同的，很多人都能用，很难具有原始创新，只有紧贴临床需求，提出一些好的研究点，解决一些临床上实际存在的痛点，才是医学科研的价值所在。案例二多组学联合：代谢+宏基因组案例来源：《Nature》 2016, IF=40.13 （Pedersen HK, et al. Nature, 2016; 535(7612):376-81.doi: 10.1038/nature18646.）原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27409811/研究目的：肠道菌群与宿主血清代谢表型及胰岛素敏感性的关系样本来源：291个非糖尿病人+75个2-型糖尿病患者研究手段：代谢组+宏基因组联合分析，找到与胰岛素抗性相关的肠道群，然后在动物模型上验证使用技术：LC-MS非靶向代谢组（检测脂相关代谢物）、GC*GC-TOF/MS非靶向代谢组（检测亲水性代谢物）、宏基因组实验设计和关键结论展示图 | 实验设计和分析流程结论1：胰岛素抗性（IR）人群的代谢表型包括：支链氨基酸（BCAA）合成、TCA循环、甘油三脂；胰岛素敏感性（IS）人群的代谢表型包括：磷脂和奇数碳原子且高不饱和的脂肪酰甘油三脂。结论2：肠道菌P. copri 和 B. vulgatus是支链氨基酸（BCAA）合成与胰岛素抗性正相关的重要驱动因素，且P. copri 肠道菌更为关键。结论3：肠道菌种群丰度的变化是导致宿主血清支链氨基酸水平改变的重要因素，并与宿主胰岛素抗性紧密相关。胰岛素抗性（IR）群体中，肠道菌P. copri 和 B. vulgatus 丰度高，B. crossotus 和 E. siraeum丰度低。前两个菌种与BCAA合成相关，后两个菌种与BCAA转运进菌体相关，肠道菌群丰度的变化导致BCAA合成增加，转运进菌体的量减少，最终导致宿主血清BCAA水平升高与胰岛素抗性。小鹿简评本文是肠道菌群与疾病相关研究的一篇经典论文利用了两个平台（LC-MS和GC*GC-MS）对血清代谢组进行了全覆盖，同时与大样本的宏基因组数据进行了关联分析，找出胰岛素抗性相关的代谢表型（BCAA升高）同时又追溯了与此代谢表型相关的几个重要的肠道菌群种属，并在动物模型上进行了验证。整个实验设计和分析简洁清晰且逻辑严密，最终的结论既阐明了胰岛素抗性的机制，又给糖尿病治疗带来了有价值的新治疗策略，是一篇兼具理论价值和临床应用价值的论文。小鹿物语条件允许的情况下，LC-MS 和GC-MS的联合分析对代谢物进行全覆盖是一个很好的策略，毕竟不同平台对代谢物的检测还是有明显偏向性的。此外，代谢组与肠道菌群的关联分析是解析肠道菌群与某种疾病关系的必要一环。仅依靠代谢组分析是没办法注释到某种肠道菌群上去的，因为很多初级代谢物，如氨基酸、脂等既可能来自于食物、又可能来自于肠道菌合成，也可能来自于宿主自身合成，同时肠道菌群的种属异常多，且初级代谢物也是菌体生命活动的基本保障，因此不进行关联分析而直接给代谢物进行肠道菌种属的注释，可能不太严谨。结语那么如何缓解“导师恐惧症”呢？为了缓解“导师恐惧症”，小鹿带来了【小鹿话代谢系列】为各位科研人带来好的研究思路和站得住脚的论据，以此“说服”导师，如果还需要增加一剂疗程，可关注下期小鹿话代谢——纯代谢组学（医学篇）！另外，针对本期小鹿分享的医学代谢组学的机制研究中，易明学院明学院也推出了原文作者国家肝癌科学中心助理研究员彭博所著课程。详情请百度搜索易明学院访问~~更多小鹿话代谢系列◆组学课程大放送：科研人打开双11的最佳方式：快速解锁你的科研技能◆临床微量样本检测策略：临床SCI研究福音：FFPE、微量样本等临床样本怎么研究？有这招就够啦◆小鹿话代谢系列：还在为实验发愁？看完这篇科研好文我被“种草”了◆小鹿话代谢系列：代谢组学——后基因组时代新热点END文章来源于鹿明生物

代谢组学（Metabolomics）以生物体内所有代谢产物为研究对象，定性定量地研究代谢物与机体生理或病理变化之间的关系。近年来，时间序列代谢组学（J Biol Chem. 292: 19556-64, 2017）和多类别代谢组学（Science. 363: 644-9, 2019）备受关注，因而对这些研究中的复杂组学数据的统计分析已经成为领域内极富挑战的前沿方向。其中，对上述代谢组数据的预处理一直存在方法繁多、性能不一、缺乏评估等严重影响处理效能的关键问题（J Proteome Res. 13: 3114-20, 2014）。针对上述问题，浙江大学药学院朱峰教授课题组，在其开发的数据归一化工具NOREVA的基础上，构建了用于时间序列和多类别代谢组学数据预处理的新型服务系统（https://idrblab.org/noreva/）。该项研究工作于近期发表在《Nucleic Acids Research》杂志上（如下图），为代谢组学研究提供了新颖的解决方案。1实现了对预处理的全面扫描和系统评估基于朱峰课题组提出的标准化新策略（Brief Bioinform. 21: 2142-52, 2020），实现了对数百种代谢组数据预处理流程的全面扫描。基于五个独立标准的评估策略（Mol Cell Proteomics. 18: 1683-99, 2019），实现了对所有预处理流程的系统评估。这些功能，使得这一新系统能够有效的针对时间序列和多类别代谢组学数据（如下图），开展预处理流程的全面扫描和系统优化，此新系统也因此成为了其他可用工具的重要补充。2提升了时间序列代谢组数据预处理的效能预处理的正确应用必须保持“真”标志物（如临床已知标记物、加入的标准化合物等）的变化水平。作为色氨酸的代谢物，犬尿氨酸被报道将在疟疾感染患者的血浆中显著升高，同时在治疗后会恢复正常。基于新系统对代谢组学基准测试数据的处理和评估，在三个时间点（疟疾感染前、诊断确定日和治疗后三周）的分析结果显示（如下图）：评测效能优异的数据预处理流程（a和b）能有效保存犬尿氨酸的生物变化（疟疾感染后在血浆中升高，且经治疗后显著下降）；相反，评测效能较差的数据预处理流程（c）几乎无法保留这种变化。换言之，新系统可以有效提升时间序列代谢组数据预处理的效能。3系统优化了多类别代谢组数据预处理流程新系统在多类代谢组学数据预处理中的应用显示：对于按照不同浓度配比添加的九种标准化合物（spiking compounds）来说，评测效能优异的数据预处理流程（a）能有效保存所有九种化合物的浓度配比梯度（如下图）；相反，评测效能较差的数据预处理流程（b）则完全无法保留各个化合物的浓度差异（如下图）。换言之，此新系统可以系统优化多类别代谢组数据预处理的流程。4研究总结本研究构建的新型在线服务系统（https://idrblab.org/noreva/）实现了对时间序列和多类别代谢组学数据的预处理，首次通过多角度评估实现了对数百种代谢组数据预处理流程的全面扫描（如下图）。对基准测试数据的案例分析验证了此新系统的重要性和有效性。随着组学研究的普及和深入，此新系统和其他工具可以共同为相关领域的研究做出贡献。此项研究工作共同第一作者为浙江大学药学院的杨庆霞博士和王云霞博士。参考资料Yang, QX; Wang, YX; Zhang, Y; Li, FC; Xia WQ; Zhou, Y; Qiu, YQ; Li, HL; Zhu, F*. NOREVA: enhanced normalization and evaluation of time-course and multi-class metabolomic data. Nucleic Acids Research. 48: 436-48 (2020).

多重研究手段助力微生物研究克服单一组学研究的局限性。一、代谢组学介绍代谢组学(metabolomics)是继基因组学和蛋白质组学之后发展起来的新兴的组学技术，是系统生物学的组成部分。其对生物体内所有小分子代谢物进行定性定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式，其研究对象大都是分子量1500Da以内的小分子物质。 二、代谢组学特点1、关注内源化合物内源性化合物的研究可应用于疾病的诊断和药物筛选。2、对生物体内小分子化合物进行定量定性研究小分子化合物的上调和下调指示了与疾病、毒性、基因修饰或环境因子的影响，可更准确的反映生物体的病理生理状态。3、最靠近表型的组学代谢组学是探究生物现象结果的科学，基因和蛋白表达的微小变化会在代谢物上得到放大，从而使检测更容易。 三、代谢组学优势多重严格质控，保证数据可靠性内标法消干扰，提高定量准确性自建立数据库，提升物质鉴定率组学关联分析，加深数据挖掘度 四、代谢组学分类1、分析流程2、代谢组产品参数注：高通量靶标代谢组项目需根据具体项目需求提供对应的送样要求及项目周期。 3、个性化分析结果展示注：以上个性化分析图片来源于前沿文献，仅供研究思路参考，具体分析结果以实际交付的结题报告为准。 五、多组学搭配解决微生物组学问题16S rDNA 测序和宏基因组测序可以回答“样本当中有哪些微生物，他们具有哪些功能”，而代谢组可以回答“这些功能是否真的发生了，发生的程度是什么样的”。因此，代谢组学的研究可通过与基因组学数据的联合分析，从原因和结果两方面分析生物体的内在变化，将系统生物学的研究推向更高水平。下面通过两篇文章展示代谢组+微生物组的应用实例。案例1作者：N. van Best 等期刊：Nature Communications时间：2020.07.23影响因子：12.121DOI:10.1038/s41467-020-17183-8本文通过16S+宏基因组+代谢组探究发展中的肝功能和肝脏代谢对早期肠道菌群的影响。结合代谢组学和微生物学分析与多变量分析，作者观察到了主要的年龄相关微生物和代谢变化，并鉴定胆汁酸为肠道菌群早期成熟的有效驱动力。 案例2作者：Allison M. Veach 等期刊：mSystems时间：2020.06.30影响因子：6.633DOI:10.1128/mSystems.00092-20本文通过16S+代谢组探究植物宿主从极端干旱的环境到湿润的环境如何改变地下微生物群落，发现植物与微生物之间的有益联系可以增强对非生物胁迫的耐受性。

近日，中国科学院大连化学物理研究所高分辨分离分析及代谢组学研究组研究员许国旺团队对前期提出并发展的拟靶向代谢组学方法进行系统总结和提升，相关结果形成范本在《自然-实验手册》上发表。代谢组学是研究内源性代谢物的科学，超高效液相色谱-质谱是广泛使用的分析工具。代谢组学分析策略主要有非靶向和靶向两种，前者一般使用高分辨质谱获得丰富的代谢物信息，但存在数据复杂、重复性差、线性范围窄等缺点；后者一般使用三重四极杆质谱，数据质量有很大提高，但通常只检测已知代谢物，覆盖度低。针对上述特点，该研究团队于二零一二年首次提出拟靶向代谢组学的概念。其创新之处在于，提出了一种定量离子选择算法，用于对所有检测到的代谢物进行定量离子选择，通过保留时间锁定气相色谱-质谱选择离子监测方式，样品中已知和未知的代谢物均可被测量，该方法兼具非靶向和靶向代谢组学的优点。二零一三年，该方法被延伸到液相色谱-质谱领域，在方法建立时用高分辨质谱获取代谢物的离子对信息，而在实际样品分析时采用靶向的多反应检测（MRM）方式测量代谢物的丰度，方法覆盖度高、线性和重复性良好，且不需要标样来限定检测的代谢物。为提高方法建立的效率，该研究团队进一步开发自动挑选离子对的软件，并建立针对大规模临床样本分析的数据校正方法，对超千个样品的分析也获得了较好的重复性。在此基础上，为提高方法中包含的离子对个数，提高覆盖度，该研究团队发展了基于SWATH技术的拟靶向代谢组学方法，在正离子下即可在血浆中获得1373个离子对。在研究脂质结构-质谱特征规律、色谱保留规律的基础上，该研究团队建立了高覆盖度拟靶向脂质组学分析新方法，涵盖19个脂类、3377个脂质离子对，覆盖7000多种脂质分子结构。在近期的工作中，为进一步提高覆盖度，该研究团队在高峰容量的二维液相色谱-质谱系统上建立拟靶向方法，正离子模式和负离子模式分别检测到1294和687个离子对，建立的二维液相色谱-质谱拟靶向代谢组学方法可用于分离分析氨基酸、胆汁酸、肉碱、溶血磷脂、鞘脂、磷脂和甘油三酯等。这些方法已在恶性肿瘤（肝癌、肺癌）和糖尿病等代谢性疾病的研究中发挥积极作用。目前，高覆盖度的（半）定量代谢组学方法在生命科学各领域均受到重视，拟靶向方法将会起到越来越重要的作用。为促进更多的同行使用拟靶向方法，基于上述前期工作，以血清/血浆为例，该研究团队进一步优化拟靶向代谢组学建立流程，升级并提供开放式软件和工具，形成方法范本。相关工作得到国家自然科学基金项目、国家重点研究开发计划项目、大连化物所科研创新计划项目的资助。来源：中国科学院大连化学物理研究所论文链接：https://www.nature.com/articles/s41596-020-0341-5

前言2020年10月Science期刊发表的题为 “Multi-omics analyses of radiation survivors identify radioprotective microbes and metabolites”的研究成果，通过16S rRNA基因测序和代谢组学研究方法，探究了肠道菌群与放疗辐射的相关性，发现了具有防护作用的特征微生物菌群和代谢物，首次探究肠道菌群对放疗辐射的保护机制，为其临床研究提供了理论依据和基础。中文标题：多组学分析可识别辐射幸存者的辐射防护微生物和代谢物英文标题：Multi-omics analyses of radiation survivors identify radioprotective microbes and metabolites研究对象：粪便样本发表期刊：SCIENCE影响因子：44.372发表时间：2020.10.30运用生物技术：16S rRNA基因测序、靶向代谢组学+非靶代谢组学研究背景大剂量电离辐射的毒性会诱发急性辐射综合症，进一步表现为造血、胃肠道和脑血管综合症。肠道是辐射的主要目标，也是肠道菌群的生长场所。尽管少量描述性研究已显示肠道菌群与辐射引起的损害之间存在潜在相关性，但其基础仍然不清楚。作者发现一种C57BL/6J小鼠在高剂量的全身辐射中能存活下来，它们与不能在辐射中幸存的小鼠具有相同的遗传背景，因此促使研究方向转向寻找与放射防护有关的微生物群差异。为了更好地了解肠道微生物组与辐射诱发的损伤之间的相互作用，作者进行了微生物群过继转移实验以及单关联研究，以研究肠道辐射模型中肠道细菌群落和特定细菌菌株的功能，并通过代谢组学技术发现了在放射防护中起重要作用代谢物。实验思路研究方法1.实验对象6-8周野生型C57BL / 6J小鼠（雄性和雌性）全身经过8.0至9.2 Gy的辐射（未经受辐射小鼠作为对照组）。经过辐射30天后未表现出损伤或伤害的小鼠被认为是精英幸存者。辐射后第290天，收集粪便样本进行微生物组分析。2.防辐射效果验证试验（1）脏笼共享实验将六至八周大的SPF C57BL / 6J小鼠关在对照组和精英幸存者生活过的带有粪便的脏笼子中，持续8周每周将小鼠转移到新的脏笼中，最后一天这些小鼠接受高剂量的全身辐射，辐射前收集粪便DNA用于微生物组分析。（2）粪菌移植（FMT）实验GF或SPF C57BL / 6J小鼠每周两次服用对照组和精英幸存组的粪便，持续4周（GF受体）或8周（SPF受体），最后一次FMT后接受高剂量辐射，辐射前收集粪便DNA用于微生物组分析。（3）服用益生菌实验SPF C57BL / 6J小鼠先接受抗生素治疗（20 mg链霉素/小鼠）一天后，每周两次给小鼠喂食Lachnospiraceae(毛螺菌科)菌株，持续8周。最后一次给药后，接受者接受高剂量的全身辐射治疗。（4）短链脂肪酸（SCFA）和色氨酸治疗实验3、辐射临床效果评价实验（1）组织病理学实验：脾脏，股骨，小肠和结肠；（2）肿瘤接种和放射治疗；（3）粘蛋白的免疫标记以及测量粘液层和隐窝长度；（4）肠通透性检测，骨髓干细胞内ROS水平检测；（5）分离骨髓干细胞、肠上皮细胞和肠上皮内淋巴细胞；（6）免疫印迹分析：骨髓干细胞，肠上皮细胞，肠上皮内淋巴细胞或脾脏组织；（7）流式细胞仪分析；4、组学实验（1）16S rRNA基因测序；（2）代谢组学实验：短链脂肪酸靶向定量检测；LC-MS非靶向代谢组学；5、其他临床数据21名白血病患者接受放疗前的粪便；研究结果1、精英幸存者存在独特的微生物经过高剂量辐射（9.2 Gy）后，有5至15％的SPF C57BL / 6小鼠（被称为“精英幸存者”）可以长期存活（600天以上）（图1A）。为了确定肠道微生物群是否对精英幸存者具有特异性，作者在辐射后第290天对粪便微生物进行了高通量16S rRNA基因测序分析，分析结果显示，精英幸存者与对照组相比具有独特的微生物群落（图1B）。可通过UniFrac差异距离分析（图1C）进一步量化数据，并得到微生物分类单位的热图（图1D）。从这些结果可推测：特定肠道菌群可以防止辐射损伤。图1 | 与对照组相比，“精英幸存者”有独特的肠道菌群2、微生物群介导的放射防护（1）脏笼实验证实精英幸存者的微生物群可促使宿主抵抗高剂量辐射在精英幸存者（ES-Recip）脏笼中饲养的小鼠（接受者）有近75％能在高辐射下存活，而在对照组（Ctrl-Recip）脏笼中饲养的小鼠只有20％存活（图2B）。ES-Recip（图2C）小鼠的临床评分显著较低。组织学研究结果表明，与Ctrl-Recip小鼠相比，ES-Recip骨髓标本基质损伤减少、胱天蛋白酶3标记的造血细胞死亡减少以及Ki67染色增强。ES-Recip小鼠的脾脏结构接近正常，白色牙髓富含淋巴细胞的卵泡，红色牙髓表现出髓外造血。相反观察到Ctrl-Recip脾脏明显萎缩和淋巴细胞减少。在来自ES-Recip小鼠的脾脏中也观察到裂解的半胱天冬酶3染色和免疫印迹的减少以及Ki67染色增加。这些结果表明，精英幸存者的微生物群可通过促进造血细胞增殖和减少细胞死亡来介导宿主抵抗高剂量辐射。16S rRNA基因测序分析结果显示，与Ctrl-Recip小鼠相比，ES-Recip小鼠的微生物组组成有所不同（图2，D和E）。即与对照组相比，Erysipelotrichales菌丰度显著下降，同时精英幸存者中拟杆菌和梭状芽胞杆菌的丰度增加。接受者的微生物组组成与其各自供体的相似，表明脏笼共享策略可以有效地将肠道菌群从提供者交换到接受者（图2D）。（2）粪便微生物群移植（FMT）实验证实微生物与辐射防护的关系FMT实验发现，精英幸存者使GF和SPF小鼠的存活率提高，与对照小鼠相比，临床得分降低（图2，I和J）。使用线性判别分析（LDA）直接比较GF ES-Recip和Ctrl-Recip小鼠的粪便微生物丰度，ES-Recip小鼠中八种分类单元增加，而五种分类单元减少（图2M）。火山图显示， Lachnospiraceae（毛螺菌科）是ES-Recip小鼠中最丰富的微生物（图2N）。图2 | 来自精英幸存者的肠道菌群可以保护GF和SPF小鼠免受辐射诱发的死亡（3）辐射防护微生物群与人类相关性研究使用16S rRNA基因测序鉴定21位白血病患者肠道微生物组成，分析了所有患者的链霉菌和肠球菌的丰度（图3，A和B）。腹泻持续时间较短（<10天）的患者与腹泻持续时间较长（> 10天）的患者相比，鞭毛藻科和肠球菌的丰度明显更高，乳杆菌科也有增加的趋势，在患者中，Lachnospiraceae（毛螺菌科）丰度与胃肠道不良反应的发生之间存在统计学的显著负相关（图3B）。图3 | 无论是患者还是小鼠肠道菌群与辐射防护显著相关3. 小鼠微生物群的放疗后选择与人类不同，实验所用小鼠应具有相似的基础微生物组组成。为了解精英幸存者携带放射防护菌群的原因，作者调查了在辐射前后是否选择了一个独特的微生物菌群在精英幸存者中占主导地位（图3C）。对57只SPF C57BL / 6小鼠进行了高剂量的全身辐射（8.2 Gy），并在放射治疗前（第1天）和第2、7、21和30天收集粪便样本进行16S rRNA基因测序，存活超过30天的小鼠被认为是精英幸存者。辐射前（第1天）精英幸存者和非幸存者之间的微生物组成没有差异。但辐射后第7天，精英幸存者有一个与辐射后死亡小鼠不同的微生物群落（图3E）。与辐射致死的小鼠相比，具有Lachnospiraceae（毛螺菌科）和Enterococcaceae（肠球菌科）的小鼠在放疗后的第7天显示出更高的存活率（图3F）。这些数据表明，放射治疗对精英幸存者的两种菌群具有选择性。作者对Lachnospiraceae（毛螺菌科）和Enterococcaceae（肠球菌科）介导的放射防护进行深入研究。向SPF C57BL / 6小鼠接种4种微生物（图4A），前两种为Lachnospiraceae（毛螺菌科）和Enterococcaceae（肠球菌科），后两种为对照菌群，通过FMT实验发现前两种菌群能减轻放射的副作用，在放疗条件下具有放射防护作用。图4 | 毛螺菌改善了辐射诱发的综合征4. 防护辐射的代谢介质Lachnospiraceae（毛螺菌科）可产生短链脂肪酸（SFAC，维持肠道上皮以及调节免疫系统和炎症反应的重要底物）。实验发现精英幸存者或ES-Recip小鼠的粪便样品中三种SCFA（乙酸、丁酸和丙酸）的浓度均高于对照。丁酸酯也显示出明显的上升趋势，并且ES-Recip小鼠中的丙酸酯和总SCFA含量显著升高。为了确认SCFA在微生物群介导的放射防护中的作用，作者测量了高产或低产Lachnospiraceae（毛螺菌科）产生的SCFA数量，并且确认三种高产菌株进行的处理组可保护100％的小鼠免于辐射，而这三种低产菌株仅提供50％的保护。图5 | 商业相关的SCFA抑制辐射引起的死亡和伤害组织学分析表明，丙酸酯处理导致骨髓细胞增多，脾脏白、红髓恢复（图5D）。此外丙酸减弱了辐射诱导的粒细胞-巨噬细胞祖细胞（GMP），普通髓样祖细胞（CMP）和巨核红细胞祖细胞（MEP）的减少。通过Western blot检测与DNA损伤相关的蛋白质的水平，包括gH2AX（图5G）、p53和53BP1。与未接受辐射的小鼠丁酸或丙酸酯相比，ROS水平降低了50％至60％。最终作者认为Lachnospiraceae（毛螺菌科）可提供长期保护，其中丙酸保护作用长达 400天以上（图5I）。为了确定其他代谢物是否具有放射防护作用，对自精英幸存者和对照组的粪便样本进行了非靶标代谢组学测定。精英幸存者和对照之间的代谢产物差异很大（图6A和B），共找到141个差异代谢物。精英幸存者粪便中代谢最丰富的代谢产物聚集在色氨酸代谢途径中，其中吲哚3-甲醛（I3A）含量变化了5倍，而犬尿酸（KYNA）变化了8倍（图6C和D）。对这些色氨酸代谢产物进行了体内放射线抑制测试，发现这两种代谢物均能显著提高放射处理的SPF小鼠的存活率并降低其临床评分（图6E至G）。I3A和KYNA治疗组均显示约75％的存活率，且放射后的保护持续时间超过200天（图6H）。图6 | 非靶向代谢组学显示色氨酸代谢物是有效的辐射防护物相关讨论肠道微生物及其代谢组可对辐射诱发的小鼠损伤提供实质性的保护：研究表明Lachnospiraceae和Enterococcaceae的存在与恢复造血功能和修复胃肠道有关。在接受放射治疗的白血病患者中，这两种微生物分类更为丰富，且表现出轻度的胃肠道功能障碍。丙酸以及两个色氨酸途径代谢产物（I3A和KYNA）在精英幸存者中升高，并提供了长期防辐射保护。表明肠道微生物群及其代谢产物可延迟放射损伤并延长生命。短链脂肪酸可以在放射后直接促进造血作用和肠道修复，通过降低促炎细胞因子水平或诱导抗炎细胞因子白细胞介素-10，广泛抑制全身性炎症。此外本研究表明色氨酸代谢产物I3A和KYNA可以抵抗ARS。色氨酸代谢物也能减弱促炎细胞因子的反应，非靶向代谢组学方法显示色氨酸代谢物在放射幸存者中升高。色氨酸代谢物可以直接减少辐射引起的损害，是候选的辐射防护剂。除色氨酸代谢物外，精英幸存小鼠中其他代谢物也升高。需要进一步的研究确认它们是否也具有辐射防护。 研究结果过量辐射会导致急性辐射综合症，从而导致造血，胃肠道和脑血管损伤。作者调查了从高剂量辐射中仍有正常寿命的小鼠种群，这些“精英幸存者”拥有独特的肠道菌群，这些菌群在无菌和常规饲养的接受者中保护它们免受辐射引起的伤害和死亡。Lachnospiraceae和Enterococcaceae菌群家族的丰度升高与放射后造血功能的恢复和胃肠道修复有关。这些菌群含量更高的白血病患者接在接受放射治疗后表现出较轻的胃肠道功能障碍。对小鼠的代谢组学研究揭示了精英幸存者粪便中微生物产生的丙酸和色氨酸代谢物浓度增加，这些代谢物引起长期放射防护，减轻了造血和胃肠综合征，并降低了促炎反应。小鹿推荐本研究首次揭示了肠道菌群和放疗辐射之间潜在的相关性，并找到了一些关键代谢产物。文章通过微生物16S rRNA基因测序分析，找到通过精英幸存者小鼠特有肠道菌群，使用特有的“脏笼实验”，并结合临床病例，揭示了不同菌群和短链脂肪酸代谢相关的保护机制，并使用非靶向代谢组学手段找到了具有放射防护功能的色氨酸代谢物。实验设计详实、逻辑性强、数据充分，实验结果具有较大的临床转化意义。是一篇基础研究和临床研究结合的典范。16S+代谢组学 /鹿明生物/本文运用肠道菌群16S rRNA基因测序+代谢组学研究首次揭示了藏到菌群和放疗辐射之间潜在的相关性，并找到了一些关键代谢产物。鹿明生物针对16S+代谢组学特推出了多组学研究活动，助力各位老师的组学研究~参考文献：1. M. Hauer-Jensen, J. W. Denham, H. J. Andreyev, Radiation enteropathy: Pathogenesis, treatment and prevention.Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 11, 470–479 (2014).2. A. K. Shadad, F. J. Sullivan, J. D. Martin, L. J. Egan, Gastrointestinal radiation injury: Prevention and treatment. World J. Gastroenterol. 19,199–208 (2013).3. A. L. Kau, P. P. Ahern, N. W. Griffin, A. L. Goodman, J. I. Gordon, Human nutrition, the gut microbiome and the immune system. Nature 474, 327–336 (2011).4. P. A. Crawford, J. I. Gordon, Microbial regulation of intestinal radiosensitivity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13254–13259 (2005).5. M. A. Ciorba et al., Lactobacillus probiotic protects intestinal epithelium from radiation injury in a TLR-2/cyclo-oxygenase-2-dependent manner. Gut 61, 829–838 (2012).猜你还想看◆16S+代谢组学：项目文章 | IF:11.607 恭喜李建明课题组16S+代谢组学文章喜登微生物顶刊Microbiome◆16S+代谢组学：项目文章PBP | 浙江工业大学傅正伟运用GC-MS非靶向代谢组学和16S探究水稻根际微生物群落影响◆16S+代谢组学：Hepatology | 运用16S+靶向代谢组学可区分重度饮酒和酒精性肝炎患者◆16S+代谢组学：16S+代谢组学助力发文医学一区行业顶刊《Gastroenterology》END文章来源于鹿明生物

● 前言2020年11月华南农业大学张志祥课题组在Scientific Reports期刊上发表题为“Integrated LC–MS and GC–MS based untargeted metabolomics studies of the effect of Azadirachtin on Bactrocera dorsalis larvae”的研究成果。通过LC-MS和GC-MS的非靶向代谢组学研究方法，研究分析内源性代谢物的变化以及印楝素对背侧双歧杆菌幼虫的生化作用。为印楝素应用在农药中主要活性成分提供了新见解。中文标题：基于LC-MS和GC-MS的综合非靶向代谢组学研究印楝素(Azadirachtin)对背侧双歧杆菌幼虫的影响研究物种：背侧双歧杆菌幼虫发表期刊：Scientific Reports发表时间：2020年运用生物技术：GC-MS代谢组学、LC-MS代谢组学（双平台代谢组学）● 研究背景印楝素对数百种节肢动物表现出优异的生物活性。然而，目前关于其对背侧双歧杆菌幼虫的生化作用的了解还不够深。背侧双歧杆菌幼虫是对热带和亚热带水果和蔬菜具有破坏性的多食性和入侵性昆虫害虫；人们发现这种东方果蝇会袭击许多类型的商业水果和各种农产品。关于印楝素对背侧双歧杆菌幼虫作用的研究很少。苦楝树提取物可以有效地降低刚出生的背侧双歧杆菌幼虫的繁殖力、生育能力、以及胚胎后发育。本文研究印楝素影响昆虫内源性代谢产物在生化水平上发挥的作用，探究印楝素降低背侧双歧杆菌幼虫的寿命和繁殖力的影响。● 研究方法1.研究材料在实验室中，将背双歧杆菌的种群保持在25±1°C，16：8 h(光照：黑暗)周期和70–80％RH下。幼虫饮食由玉米粉，酵母，蔗糖，纸巾，盐酸，苯甲酸钠，香蕉和水组成，而成虫饮食由水，酵母和糖组成。这些实验包含两组，即对照（CK）和1μg/ g 印楝素（Tr）。2.组学分析GC-MS非靶向代谢组学分析；LC-MS非靶向代谢组学分析；● 研究结果1.GC-MS和LC-MS分析幼虫的生物活性研究通过GC-MS非靶向代谢组学和LC-MS非靶向代谢组学分析代谢物谱发现，如图1a所示，就发育持续时间而言，实验（Tr）组的9.59±0.27天显着长于对照组（CK）组的8.23±0.11天（P <0.01）。如图1b所示，就生存率而言，Tr组的19.78±1.5％显着低于CK组的88.56±1.4％（P <0.001）。如图1c所示，Tr组的weight重量0.084±0.007 mg显着低于CK组的0.112±0.003 mg（P <0.05）。图1 | 印楝素对背侧双歧杆菌幼虫的生物活性数据表示为平均值±SE。*表示P <0.05，**表示P <0.01，****表示P <0.001。2.GC-MS和LC-MS的PCA分析PCA用于检查GC-MS代谢组学和LC-MS代谢组学分析数据的质量。他们证明所有CK、Tr和QC（质量控制）样本均在95％的Hotelling的T平方椭圆内，并且明显分成几类。在这些样本中未发现异常。在GC-MS代谢组学分析中，第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）解释了所有样品总方差的28.4％和27％（图2a），在ESI模式下，PC1和PC2解释了所有样本总方差的45.6％和13.8％（图2b）。在ESI +模式下，PC1和PC2解释了总方差的35.9％和23.9％（图2c）。图2 | PCA得分图来自（a）GC-MS；（b）背杆幼虫LC-MS代谢物谱中的负离子模式（ESI-）和（c）阳离子模式（ESI +）的PCA得分图；3.GC-MS和LC-MS的最小二乘判别分析通过最小二乘判别分析（PLS-DA）来区分对照组和印楝素的暴露组之间的代谢物。这些PLS-DA模型中的CK和Tr组在95％的Hotelling的T平方椭圆形内，并显示出清晰的分离度（图3）。进一步进行了7倍内部交叉验证和200次排列检验，以评估这些模型的预测准确性和统计意义。在GC-MS代谢组学分析中，PLS-DA模型的预测准确性参数为R2Xcum = 0.48，R2Ycum = 0.985和Q2Ycum = 0.843；其相应的统计显着性分别为R2 = 0.793和Q2 = -0.0593（图3a）。在ESI模式下，PLS-DA模型的预测精度参数为R2Xcum = 0.576，R2Ycum = 0.999和Q2Ycum = 0.96；其相应的统计显着性分别为0.844和0.0944（图3b）；在ESI +模式下，PLS-DA模型的预测准确性参数为R2Xcum = 0.573，R2Ycum = 0.992和Q2Ycum = 0.959；其相应的统计显着性分别为0.859和0.107（图3c）。根据以下标准，如果左侧的所有蓝色Q2值均低于右侧的原始点，或者Q2点的蓝色回归线与垂直轴相交于零或零以下，则这些PLS-DA模型过度拟合的概率较低。以上结果表明，这些PLS-DA模型可以识别CK和Tr组之间差异富集的代谢产物。图3 | PLS-DA得分图（左）与相应的置换测试图（右）源自（a）GC-MS，（b）LC中的负离子模式（ESI-）和（c）正离子模式（ESI +)的MS代谢物谱。4.GC-MS和LC-MS的总离子色谱图在CK和Tr组之间改变了背侧双歧杆菌幼虫的代谢产物。相关的背侧双歧杆菌幼虫组织样品的GC-MS和LC-MS总离子色谱图（TIC）如图4所示。其显示了CK和Tr组之间的峰的形状和数量变化。在LC-MS代谢组学的ESI-和ESI +模式下，约7328和13375个代谢物峰被解卷积。相比之下，GC-MS代谢组学中有415个代谢物峰被解卷积。通过Metabo Analyst 4.028中的缺失值插补，过滤和标准化，进一步处理了这些反卷积数据。使用现有数据库中的参考资料进一步注释了LC-MS中ESI-和ESI +模式下的总共1979个峰和3904个剩余峰以及GC-MS中的235个剩余峰。除去GC-MS中的副产物和LC-MS中的外源化合物后，根据PLS-DA模型的VIP值（VIP> 1.2）和Student's t校正的P值（q值<0.05），选择差异丰富的代谢物。表1显示了LC-MS代谢组学分析中22种差异丰富的代谢物中的15种被上调。表2说明了GC-MS代谢组学分析中13种差异丰富的代谢物中的两种被下调了。如表1和表2所示，十种氨基酸和衍生物是差异最大的代谢产物，其次是七种碳水化合物，六种脂质，六种核苷，三种有机酸以及两种维生素和辅因子。图4 | GC-MS/LC-MS离子图从（a）GC-MS，（b）LC-MS中的负离子模式（ESI-）和（c）阳离子模式（ESI +）获得的背侧双歧杆菌幼虫组织提取物的典型TIC。左图为CK样品，右图为Tr样品5.GC-MS和LC-MS的KEGG分析通过Metabo Analyst 4.0对差异丰富的代谢物进行KEGG途径分析，来鉴定由Metabo Analyst所引起的代谢途径紊乱。使用存储在KEGG数据库中的参考图构建了示意图概述（图5），背侧双歧杆菌幼虫中存在的14种差异富集的代谢途径中的18种差异代谢物值得关注。图5 | 代谢途径的示意图用印楝素饮食喂养的背侧双歧杆菌幼虫中主要受影响的代谢途径的示意图。红色表示代谢物增加，绿色表示代谢物减少作者将这些差异丰富的代谢途径总结为氨基酸，碳水化合物，核苷以及维生素和辅因子代谢。在这些差异丰富的代谢途径中，有七个的途径影响值超过0.1，这是途径富集和拓扑分析后的相关性阈值。基于负log（P）和影响值，作者表征了组氨酸代谢，d-谷氨酰胺和d-谷氨酸代谢，生物素代谢，抗坏血酸盐和藻酸盐代谢，戊糖和葡糖醛酸酯相互转化以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢作为印楝素对背侧双歧杆菌幼虫影响的重要相关途径；它们的影响值分别为0.5、0.33、0.25、0.25、0.22和0.17（图6）。图6 | 代谢途径的代谢组图背侧双歧杆菌幼虫特征的代谢途径的代谢组图（CK和Tr组）。显示了基于富集和拓扑分析的显着改变的途径。x轴代表途径富集，而y轴代表途径影响。大尺寸和深色分别代表主要途径富集和高途径影响值。● 研究讨论在这项研究中，人工加入印楝素可显着延长背侧双歧杆菌幼虫的发育时间，并降低背侧双歧杆菌幼虫成活率和体重。尽管这种情况与实地应用的实际情况大不相同，因为背侧双歧杆菌幼虫在果实内部，并且缺乏印楝素能穿透果皮和果肉的证据，但是代谢组学分析为印楝素对背侧双歧杆菌幼虫的生化影响提供了新的见解。印楝素会显著减少脂肪酸的数量和相对组成。但是，在这项研究中，仅发现六个脂质或类脂质分子差异丰富，并且没有一个脂质代谢途径被富集。因此，应考虑针对脂肪酸或脂质组学的目标代谢组学，以研究印楝素对背侧双歧杆菌幼虫脂质的更全面的作用。印楝素被证实会影响背侧双歧杆菌幼虫的碳水化合物代谢。在这项研究中，琥珀酸和苹果酸是TCA周期中两种差异富集的代谢产物。TCA循环（称为柠檬酸循环）具有两个重要功能。首先涉及用于合成氨基酸和脂肪酸的中间体化合物。另一个涉及大量ATP的形成，为各种合成过程提供能量，背侧双歧杆菌幼虫中此类代谢物的下调表明，在用印楝素饮食喂养的背侧双歧杆菌幼虫中，中间化合物和能量产生不足。木糖醇可以用于TCA循环中，并且可以通过戊糖和葡萄糖醛酸酯互变转化为木酮糖和阿拉伯糖醇，因此这些糖的相对含量变化有望影响能量的产生和中间化合物的产生，从而维持正常的生物过程。印楝素也被发现会影响背侧双歧杆菌幼虫的氨基酸代谢。谷氨酸参与许多生化途径，被认为是连接碳和氮代谢的关键代谢产物。组氨酸、d-谷氨酰胺和d-谷氨酸代谢以及丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢可导致处理后的背侧双歧杆菌幼虫谷氨酸含量升高，从而将含氮代谢物进一步转化为TCA循环以弥补不足能量和中间化合物。由于组氨酸通常在酶的活性位点中起关键作用，因此必须将其维持在相对较高的含量下，才能满足以印楝素饮食喂养的背侧双歧杆菌幼虫中酶反应的需要。印楝素还影响了背侧双歧杆菌幼虫的维生素和辅助因子代谢，包括生物素，也称为维生素B7或维生素H。在这项研究中，处理过的背侧双歧杆菌幼虫中生物素含量相对较高，可能与该辅因子在糖异生，脂肪酸合成和氨基酸分解代谢的中间代谢中发挥的关键作用有关。肌醇被认为是一种类似维生素的必需营养素。由于琥珀酸和苹果酸的下调导致中间化合物和能量的不足，因此肌醇通过半乳糖代谢转化为TCA循环，从而导致其含量相对较低。肌醇也可能部分导致了用印楝素饮食喂养的背侧双歧杆菌幼虫的生长不良，因为印楝素缺乏会导致消化和食物利用效率低下以及虾和鱼的生长不良。● 研究结论在LC-MS和GC-MS的代谢组学结果中，分别选择了一共22种和差异较大的13种代谢物，来分析印楝素对它们的作用。分析表明，14种差异丰富的代谢途径，包括7种有影响的途径，值得关注。进一步的代谢途径分析表明，印楝素对背侧双歧杆菌幼虫的组氨酸代谢，d-谷氨酰胺和d-谷氨酸代谢，生物素代谢，抗坏血酸盐和藻酸盐代谢，戊糖和葡萄糖醛酸酯相互转化以及丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢途径有影响。该发现说明印楝素对背侧双歧杆菌幼虫的初级代谢具有显著影响。小鹿推荐代谢组学是一种强大的生物分析工具，已广泛用于昆虫科学，例如发现农药的作用方式，棉铃虫的发育迟缓的原因，辐射诱发的昆虫不育技术以及对昆虫的不育研究等... ...在这项研究中，课题组测试了印楝素对背侧双歧杆菌幼虫的生物活性，介绍了一种使用UPLC-QTOF-MS和GC-Q-MS进行整合的非靶向代谢组学的方法，以探索内源性代谢物的变化及其潜在的生物学意义。虽然将本研究的生物活性结果推论到背侧双歧杆菌有害生物管理项目中是不合适的，但综合代谢组学分析表明，印楝素可能对背侧双歧杆菌幼虫的碳水化合物，氨基酸，维生素和辅助因子代谢产生重大影响，这为印楝素在农药中作为主要活性成分提供了新见解。文末看点上海鹿明生物科技有限公司，一直专注于生命科学和生命技术领域，是国内早期开展以蛋白组和代谢组为基础的多层组学整合实验与分析团队。欢迎百度搜索鹿明生物——访问鹿明生物官网——咨询鹿明生物专业技术工程师// 长按扫码即可咨询 //获取原文咨询鹿明生物技术工程师咨询样本准备部分参考文献1. Clarke, A. R. et al. Invasive phytophagous pests arising through a recent tropical evolutionary radiation: The Bactrocera dorsalis complex of fruit flies. Annu. Rev. Entomol. 50, 293–319 (2005).2. Mulla, M. S. & Su, T. Activity and biological effects of neem procts against arthropods of medical and veterinary importance. J. Am. Mosquito Contr. 15, 133–152 (1999).3. Schmutterer, H. Properties and potential of natural pesticides from the neem tree, Azadirachta indica. Annu. Rev. Entomol. 35, 271–297 (1990).猜你还想看◆如何玩转热点研究？蛋白4D-DIA+代谢双平台3h知识干货带您入门！◆4D-DIA技术：4D-DIA技术 | 蛋白质组学领军科学家带您走进4D组学新时代◆4D-DIA技术："稳中带皮"跨实验室比较展示基于DIA的质谱工作流程稳定性及潜力◆GC/LC双平台技术：项目文章| Circulation,IF=23.054复旦大学重点实验室发表颗粒物暴露与应激激素水平试验研究◆GC/LC双平台技术：项目文章 | 中国农科院茶叶研究所陈亮博士对白化茶和绿茶品种代谢变化的研究END文章来源于鹿明生物

timsTOF pro新一代4D质谱仪鹿明生物2020年11月新晋成员布鲁克 tims TOF Pro由于离子淌度分离概念的引入使得蛋白质组学进入了4D新时代。4D-Proteomics是在3D分离即保留时间（Retention time）、质荷比（m/z）、离子强度（Intensity）这三个维度的基础之上增加了第四个维度，离子淌度（Mobility）的分离（图1），进而大幅度的提高扫描速度和检测灵敏度，带来蛋白质组学在鉴定深度、检测周期、定量准确性等性能的全面提升。特点&4D-DIA蛋白组学● 近乎100%的离子利用率，提升检测灵敏度；● 更高的检测深度和覆盖度；● 定量重复性、完整性、可靠性全面提升；基于新一代4D蛋白质组学，研究者将能够对复杂样品的分子机制进行更深入的研究、提高发现低丰度生物学重要蛋白质的可能性，并在转化医学、临床蛋白质组学等研究中具有广泛的应用前景，也标志着蛋白质组学正式进入“4D 新时代”。大家是否有以下困惑：4D-DIA技术如何助力您的科研，玩转热点研究？ 4D-DIA技术目前的进展与应用如何？国自然项目有哪些热点？蛋白组学4D-DIA技术如何结合代谢组学技术做联合研究？为此鹿明生物特邀布鲁克应用工程师杜潇贤老师和大家一起实时分享4D-DIA实战应用~（讲座内还有礼品抽奖环节不容错过哦~）特邀嘉宾嘉宾简介 杜潇贤 毕业于复旦大学。从事基于质谱的蛋白质组学研究，具有丰富的组学实验，质谱和数据分析经验，现任布鲁克应用工程师。报告介绍：1、4D-蛋白质组学原理和技术优势；2、dia-PASEF@技术原理介绍和技术进展；3、4D-蛋白质组学最新技术进展；嘉宾简介 方后琴 毕业于同济大学，从事蛋白质组学行业8年，具有丰富的蛋白组研究经验，熟悉DIA、标记定量及Labelfree等多种类型的质谱实验及数据分析方法，以一作在《Analytical Chemistry》期刊上发表学术论文1篇，获得国家发明专利授权2项。报告介绍：1、DIA原理、技术特点及研究流程；2、4D-DIA技术及最新研究进展；3、4D-DIA技术在蛋白质组学中的应用；嘉宾简介 钟晓彬鹿明生物华南区产品经理，负责华南区科研服务市场推广运营，从事多组学实验研究6年，擅长代谢组实验方案设计、数据分析，协助客户发表文章、申报基金，地方项目以及科研成果转化等；报告介绍：1、蛋白代谢国自然项目梳理和思路介绍，蛋白代谢项目市场前景分析；2、4D-DIA技术介绍、实验流程、高分文章研究思路和应用；3、GC-MS和LC-MS双平台技术介绍、实验操作、案例展示；4、多组学技术联合分析思路；报名方式1.关注鹿明生物公众号； 2.转发本文到朋友圈，并获得16个赞！ 3.截图发送鹿明生物公众号后台即可免费参加会议！鹿明生物&4D-DIA联合代谢组技术线上讲座猜你还想看◆4D-DIA技术：4D-DIA技术 | 蛋白质组学领军科学家带您走进4D组学新时代◆4D-DIA技术："稳中带皮"跨实验室比较展示基于DIA的质谱工作流程稳定性及潜力◆GC/LC双平台技术：项目文章| Circulation,IF=23.054复旦大学重点实验室发表颗粒物暴露与应激激素水平试验研究◆GC/LC双平台技术：项目文章 | 中国农科院茶叶研究所陈亮博士对白化茶和绿茶品种代谢变化的研究END文章来源于鹿明生物

代谢组学分析分为非靶标代谢组学分析和高通量靶标代谢组学分析。今天先向大家介绍非靶标代谢组学分析。 一、代谢组学介绍通过液质联用（LC-MS）方法检测生物体受外界刺激前后体内大多数小分子代谢物的动态变化，重点寻找在实验组和对照组中有显著变化的代谢物，进而研究这些代谢物与生理病理变化的相关关系，其研究对象大多是分子量1500Da以内的小分子物质。 二、代谢组技学术优势较高的灵敏度、分辨率；较宽的动态范围；适合对标本中未知代谢物的探索研究；适合于生物样本中复杂代谢产物的检测和潜在标志物的鉴定。 三、代谢组学分析流程四、代谢组学技术参数五、代谢组学应用方向01 土壤代谢组学研究土壤中有机质及土壤微生物代谢含量变化及相互作用，了解土壤微生物多样性及其碳代谢能力，为探索调节、控制和改善土壤环境质量提供重要的参考。02 肠道菌群代谢组学运用代谢组学检测肠菌代谢物的动态变化，了解肠道菌群在宿主中的代谢状态，直观的研究肠道菌群与疾病发生发展的关系，为疾病的预防和治疗，调高宿主的健康水平提供新的思路。03 经典脂质组学对生物体、组织或细胞中的脂质以及与其相互作用的分子进行全面系统的鉴定分析。了解脂质的结构和功能，揭示脂质代谢与细胞、器官乃至机体的生理、病理过程之间的关系，广泛运用于分子生理学、功能基因组学以及环境与健康等重要领域。 六、“非靶代谢组+ ”多组学联用16S rDNA 测序、宏基因组测序与代谢组等多组学联用可在一定程度上克服单一组学研究的局限性，显示良好应用前景。下面通过一篇2019年发表在Cell Host & Microbe的文章来展示如何使用“16S+宏基因组+代谢组”这个神器。作者：Louise B. Thingholm 等期刊：Science时间：2019.08影响因子：15.753DOI:10.1126/science.aan5931本研究通过16S+宏基因测序+代谢组学的方法，发现肥胖与人体肠道微生物的组成、某些细菌造成的功能改变、以及与肠道微生物相关的血清代谢物的显著变化有关。总之，本研究将肥胖和D2T这两种相互关联的代谢疾病的微生物成分区分开来，确定了未来研究中需要考虑的饮食和药物用量。

前言2020年，伊利诺伊大学食品科学与人类营养系课题组在Food Chemistry杂志（IF=5.8）发表题为“A comparison of the absorption and metabolism of the major quercetin in brassica，quercetin-3-O-sophoroside，to that of quercetin aglycone, in rats”的研究论文。该研究运用LC-MS代谢组学及GC-MS代谢组学技术以罗布麻中提取的槲皮素-3-O-槐苷为原料，采用大鼠原位肠道模型，对其吸收、Ⅱ期代谢及微生物分解代谢进行了研究，并与槲皮素苷元进行了比较。标题：芸薹属植物槲皮素-3-O-槐苷与槲皮素苷在大鼠体内吸收代谢的比较期刊：Food Chemistry影响因子：5.8运用生物技术：LC-MS代谢组学、GC-MS代谢组学研究背景黄酮类化合物因其在预防慢性疾病（包括心血管疾病和癌症）中促进健康的作用而被广泛认可。槲皮素是一种常见的黄酮类化合物，广泛存在于植物性食品和饮料中。与大多数黄酮类化合物一样，槲皮素通常以多种糖苷形式存在于自然界中，而不是以游离苷元的形式存在。槲皮素-3-O-槐苷（QS）是人们特别感兴趣的一种黄酮类化合物，它是西兰花中的一种主要黄酮类化合物，而西兰花是公认的抗癌和抗炎食品。近年来，食品与微生物之间的相互作用越来越引起人们的兴趣。所有类型的黄酮苷类都会部分转移到肠道下部，在那里宿主体内缺乏的微生物酶会进行广泛的分解代谢。微生物分解代谢包括槲皮素苷的脱糖基化为苷元，随后发生环分裂，导致形成多种生物活性酚酸，包括苯甲酸、苯乙酸和苯丙酸衍生物。本研究以罗布麻中提取的槲皮素-3-O-槐苷为原料，采用大鼠原位肠道模型，对其吸收、Ⅱ期代谢及微生物分解代谢进行了研究，并与槲皮素苷元进行了比较。研究思路研究方法1.实验设计从Envigo公司购买体重范围140-160克的Fischer 大鼠344只，单独关在笼子里，食物和水可随意摄取。对大鼠进行为期6天的AIN93G粉末饮食的适应。手术前12小时饮食被取消。通过空肠或盲肠给药（每组n=3~4）给每只大鼠注射QS或槲皮素苷元，收集门静脉血并分析其代谢产物。对于空肠给药，从空肠近端开始约20cm的节段通过结扎关闭。然后将15μmol槲皮素苷元或QS溶解在0.5ml丙二醇中，用2% DMSO溶解在结扎段的近端。注射后，取出针，近端立即结扎，形成封闭的空肠段，两端结扎。盲肠给药时，结扎整个盲肠，并在完全结扎前从结肠（远端）端引入材料。在材料导入之前，将导管插入门静脉（离肝脏约2cm远）以收集血液。在空肠给药后10、20和30分钟，盲肠给药后0、60、90、120和150分钟，用含60μl 2%EDTA的1 ml注射器抽取血液（600μl），以防止血液凝结。根据初步数据（未显示）选择时间点。手术后，对空肠给药的大鼠，从体内取出空肠段，精确测量长度（19–24 cm）；对盲肠给药的大鼠，收集盲肠内容物，并在-80°C下冷冻，直到分析。手术后立即将血样保存在冰上并离心收集血浆。2.检测方法从血液样本中制备血浆，以2400rpm/min（500×g）的速度离心15分钟，在4°C下离心两次，然后在-80°C下冷冻，直到分析。使用三体积的含有0.1%甲酸的甲醇提取约300μL的血浆样品。该混合物在10分钟内每2分钟涡旋30秒，在16100×g离心10分钟后，在氮气下将上清液（约1.2毫升）浓缩至约100μl。再离心后，测量上清液的体积，在LC-MS上进行定性分析，并分别在HPLC-PDA上进行定量分析。盲肠内容物冷冻干燥。测量100 mg干燥样品并在70%甲醇中浸泡。将样品在18000×g下离心10min，重复超声30秒，45秒，蒸发干燥，用100μl N-三甲基硅基-N-甲基三氟乙胺（MSTFAA）衍生，进行酚酸的GC-MS分析。采用图基多重比较试验（family wise α= 0.05）对酚酸测定的对数转换数据（base e）进行单因素方差分析。用Shapiro-Wilk检验正态分布（p≤0.05），用Brown-Forsythe检验方差齐性（p<0.05）。使用GraphPad Prism8进行分析。研究结果“槲皮素-3-O-槐苷（QS）的吸收与Ⅱ期代谢”，空肠引入QS后，完整的QS和QS的四个II期代谢物均在门脉血浆中被鉴定（表1和图1）。表1 | 所有II期代谢产物的完整列表图1 | 引入槲皮素苷元或槲皮素-3-O-槐苷（QS）后血浆II期代谢物的色谱图A图：空肠内注入槲皮素苷元后30分钟门静脉血浆样品的代表性HPLC痕量。盲肠引入aglycone后150min血浆中的代谢物模式相似，但丰度较低。B图：空肠引入QS后30分钟门静脉血浆样品的代表性HPLC痕量。盲肠引入QS后未检测到II期代谢产物或完整的QS。这四种代谢产物包括硫酸QS（峰10）、甲基化QS（两种异构体，峰13和峰14）和甲基化QS硫酸盐（峰11）、两种典型的Ⅱ期代谢活性产物、甲基化和硫酸化。另一个典型的II期代谢产物QS-葡萄糖醛酸没有被观察到，也没有任何去糖基化产物，如槲皮素苷元、槲皮素-3-O-葡萄糖苷或其II期代谢产物。空肠手术30分钟后每10分钟测定一次血浆QS的丰度（表2）。表2 | 引入槲皮素苷元或槲皮素-3-Osophoroside（QS）后，对血浆中选定的II期代谢物进行量化并进行标准统计表血浆Qs浓度随时间延长，血浆中最大浓度为3.7±1.2μm，盲肠导入QS后，150 min时门静脉血浆中无代谢产物或QS，无吸收。表3 | 原位盲肠导入150分钟后槲皮素苷元和槲皮素-3-O-槐苷（QS）的分解代谢统计表3是原位盲肠导入150分钟后槲皮素苷元和槲皮素-3-O-槐苷（QS）的分解代谢统计。由表3可以看的出苷元组和QS组之间的分解代谢模式没有差异，除了间苯三酚，它只在苷元组观察到。研究结论本研究成功地从罗布麻中分离出了纯QS，并用MS2、1H NMR 和13C NMR对其结构进行了确证，比较了槲皮素及其苷元的吸收、Ⅱ期代谢和微生物分解代谢。随着罗布麻中黄酮类化合物QS的成功纯化和大鼠原位模型的建立，作者首次报道了黄酮类化合物在小肠中被完整吸收，在空肠中被代谢为硫酸、甲基化和甲基化硫酸盐。作者的数据表明，QS可能被盲肠微生物群脱糖基化为苷元，形成苯甲酸、苯乙酸和苯丙酸的衍生物，表明QS与微生物群之间存在着积极的相互作用。新的发现表明，QS在上消化道完全吸收而没有去糖基化，这表明终糖和（或）糖苷部分之间的连接类型可能在类黄酮糖苷的吸收机制中起作用。如果吸收涉及SGLT1或GLUT所属类型则需要进一步的研究来确定通过空肠壁吸收QS的转运系统，正在进行的研究表明，通过一些黄酮类化合物与这些转运蛋白结合可能抑制糖的摄入，为糖尿病和肥胖症的控制提供了新的见解。小鹿推荐本文作者运用LC-MS代谢组学和GC-MS代谢组学对槲皮素苷与槲皮素苷吸收、Ⅱ期代谢及微生物分解代谢进行了研究，并与槲皮素苷元进行了比较。作者发现了QS可能被盲肠微生物群脱糖基化为苷元，形成苯甲酸、苯乙酸和苯丙酸的衍生物，表明QS与微生物群之间存在着积极的相互作用。QS在上消化道完全吸收而没有去糖基化，这表明终糖和（或）糖苷部分之间的连接类型可能在类黄酮糖苷的吸收机制中起作用，通过一些黄酮类化合物与一些转运蛋白结合可能抑制糖的摄入，为糖尿病和肥胖症的控制提供了新的见解。这篇文章应用到了LC-MS/MS和GC-MS代谢组学现代最流行的质谱技术，十分值得借鉴。文末看点鹿明生物精准靶向代谢组学—黄酮酚类物质Kit包。13大类、130种黄酮酚类物种绝对定性和绝对定量。采用鹿明生物检测平台AB SCIEX-QTRAP-6500+液质联用平台。保证数据的准确性和稳定性。详情请戳重磅发布|基于AB SCIEX 6500+的130种黄酮酚类物质的精准靶向代谢组学，还有拼团享钜惠活动。部分文献参考1.Jeffery,E. H., & Araya, M. (2009). Physiological effects of broccoli consumption. Phytochemistry Reviews, 8(1), 283–298.https://doi.org/10.1007/s11101-008-9106-4.2.Lai, R.-H., Miller, M. J., & Jeffery, E. (2010). Glucoraphanin hydrolysis by microbiota in the rat cecum results in sulforaphane absorption. Food & Function, 1(2), 161–166.https://doi.org/10.1039/c0fo00110d.3.Liu, X., Wang, Y., Hoeflinger, J. L., Neme, B. P., Jeffery, E. H., & Miller, M. J. (2017).Dietary broccoli alters rat cecal microbiota to improve glucoraphanin hydrolysis tobioactive isothiocyanates. Nutrients, 9(3), https://doi.org/10.3390/nu9030262.