mirna研究

MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20~25个核苷酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。作用：miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。MicroRNA存在多种形式，最原始的是pri-miRNA，长度大约为300~1000个碱基；pri-miRNA经过一次加工后，成为pre-miRNA即microRNA前体，长度大约为70~90个碱基；pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约20~24nt的成熟miRNA。扩展资料：MicroRNA存在多种形式，最原始的是pri-miRNA ，长度大约为300-1000个碱基pri-miRNA经过一次加工后，成为pre-miRNA 即microRNA前体，长度大约为70-90个碱基；pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约20-24nt的成熟miRNA。miRNAs的表达方式各不相同。部分线虫和果蝇的miRNA在各个发育阶段的全部细胞中都有表达，而其他的miRNA则依据某种更为严谨的位相和时相的表达模式——在不同组织、不同发育阶段中miRNA的水平有显著差异。参考资料来源：百度百科——micro RNA

现行的实验方案中，测序，northern blot，芯片，荧光定量实验，荧光原位杂交实验等比较常用。

去百度文库，查看完整内容>内容来自用户:周雨905小RNA项目介绍Outline1.小RNA测序概述2.小RNA测序标准流程3.后续分析（个性分析）4.案例分享小RNA基础•小RNA是指在生物体中表达的，不编码蛋白，长度较短（18~30nt或40nt）的RNA分子，参与诱导基因沉默，参与细胞生长、发育、基因转录和翻译等诸多生命活动的调控过程。•microRNA，简称miRNA，是目前功能研究较为透彻的一类小RNA(20~25nt)。miRNA通过与特定mRNA的结合调节相应基因的表达，这些基因称为该mRNA的靶基因。miRNA的结构及其形成•miRNA•长度(集中在22nt附近）；•首位碱基多数是U，是G的可能性较小；•2~4位点较少为U。miRNA的调控作用剪切调控研究背景抑制调控多见于植物多见于动物适用范围•模式物种，有参考基因组，miRNA数据库注释较多，找出新miRNA，研究miRNA的功能。•非模式物种，无参考基因组，miRNA数据库注释较少，研究物种中存在的与其他物种同源的miRNA。Outline1.小RNA测序概述2.小RNA测序标准流程3.后续分析（个性分析）4.案例分享小RNA测序技术简介•小RNA测序技术采用胶分离技术，收集样品中18-30nt或18-40nt的RNA片段，利用高通量测序技术，一次性获得单碱基分辨率的数百万条小RNA序列信息，依托强大的生物信息分析平台，鉴定已知小RNA，并预测新的小RNA及其靶标。•小分子RNA是生物体内一类重要的特殊分子，诱导基因沉默，参与细胞生长、发育、基因转录和翻译等诸多生命

RNAi是一种由双链RNA介导的序列特异性基因沉默现象。RNAi行使功能的机制与miRNA相同，都是一种在进化上十分保守的RNA-蛋白质机制。miRNA是由21至23个核苷酸组成的内源非编码RNA。随着RNA为基础的治疗方法学的不断发展与成熟，对于miRNA通路及转录后基因沉默机制的研究便显得尤为重要。已有研究发现，miRNA在人体发育和疾病发生过程中扮演着关键性的角色，并且基因表达调控的复杂程度超出人们预想。本综述将涉及miRNA成熟机制方面的进展，miRNA的作用方式及其在RNA为基础的治疗中的应用。 人们最初在植物和真菌中观察到RNAi现象——某一基因的复制性拷贝可以抑制其本身及其来源基因的表达[1,2]。Andrew Fire和Craig Mello在对线虫的研究中发现，RNAi现象是由双链RNA介导的，这一发现为两位科学家赢得了诺贝尔奖[3]。之后，David Baulcombe又证实了植物中的RNAi效应的介导者是一种由21至25个核苷酸组成的RNA剪切产物[4]。人工合成与靶标序列完全互补的由21个核苷酸组成的RNA双链，将其导入哺乳动物细胞内便可以清晰观察到RNAi效应[5]，这些外源导入的双链RNA叫做siRNA。 由于上述RNA双链的剪切产物和内源性21至23个核苷酸长度的miRNA在结构上十分相似，于是研究人员针对其作进一步研究。结果他们发现miRNA同样具有基因沉默的功能[6~10]，并且siRNA在基因沉默过程中与miRNA具有相同的机制，不过miRNA与其靶序列只是部分互补。由此，人们开始采用RNAi作为基因敲除的实验技术，有关miRNA及miRNA诱导的基因沉默现象也开始成为研究热点。目前，我们已经知道miRNA在很多重要的细胞功能，如在细胞增殖、分化、肿瘤生成、免疫功能以及其它功能中发挥着关键性作用。至于有哪些重要的生物过程有miRNA的参与则不在本综述的讨论范围之内，有兴趣的读者可以参阅文献[11]。本文的重点将集中于有关miRNA成熟机制研究及miRNA介导基因沉默方面的最新进展。 (I) miRNA生物合成 截止到撰写本文时为止，研究人员已在人类基因组中发现并注释了500多种miRNA[12]。在基因组扫描和对发夹结构进行“系统发生性遮蔽(phylogenetic shadowing)”研究的基础上，研究人员预测人类基因组中至少存在1000种miRNA[13]。目前借助进一步发展的测序技术以及其它克隆技术的新进展，研究人员鉴别出越来越多的miRNA，而这恰恰证实了确实有超出我们预期的miRNA的存在[14,15]。大约有60%的miRNA位于基因间隔区(intergenic region)，其余40%则位于蛋白编码基因或其它转录元件的内含子上[16~18,]。很多intergenic miRNA成簇分布，这样的miRNA有可能是在共同的启动子调控下表达的，因为它们具有相似的表达谱[18]。与上述情况相反，内含子miRNA(intronic miRNA)则更可能是在其所在基因的启动子下表达的，因为大多数intronic miRNA的表达与寄主mRNA的表达相似[18]。不过，也有一些例外，这暗示我们有些intronic miRNA具有独立的启动子[19]。 接下来对intergenic miRNA的启动子进行阐述。大部分miRNA启动子需要募集RNA Pol II，且未显示出任何与蛋白编码基因不同的特性[20~23]。它们同样需要募集转录因子以进行时间及空间特异性的基因表达。miR-223就是其中一例，miR-223是一种单核细胞特异性miRNA，其启动子至少包含单核细胞特异性转录因子PU.1以及C/EBP功能性结合位点[24]。miR-146a则是由内毒素诱导而产生的miRNA，它的转录受自身启动子内NF-kB的结合位点调控[25]。另外，miR-375是β细胞特异性miRNA，它可反向调节胰岛素的分泌[26]，这种位于斑马鱼β细胞内的miRNA在胰腺发育中具有重要作用[27]。据推测其miRNA编码区的上游和下游均有β细胞特异性转录因子Pdx1[28]的结合位点。 miRNA通常由RNA Pol II转录,一般最初产物为大的具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的pri-miRNA[20,22]。这些pri-miRNA可长达几千个碱基。成熟miRNA序列通常仅位于构成发夹结构的其中一条链上(见图1A)。在哺乳动物细胞内，pri-miRNA在核内由“微处理器(microprocessor)”复合物进行处理，复合物由RNase III enzyme Drosha [29]、DGCR8 (DiGeorge critical region-8)及一个双链RNA结合蛋白[30,31,32]组成。Drosha从pri-miRNA发夹结构末端切下11个核苷酸，切割后的产物在3’端有两个碱基突出，在5’端为磷酸盐基团[29]。体外试验证实，microprocessor复合物可以从发夹结构上“量出”11个核苷酸，在单链RNA与发夹结构结合处将11个核苷酸组成的片段切下，切割后的65至75个核苷酸长度的茎环结构就叫做pre-miRNA(见图1C)。 研究人员构建DGCR8基因的敲除小鼠模型[33]。与Dicer敲除小鼠[34]一样，纯合型DGCR8基因敲除小鼠胚胎在第6.5天可观察到异常，并在第12天时胚胎出现死亡进而被机体重新吸收。这一结果表明DGCR8乃至miRNA在机体发育过程中起着关键性的作用。DGCR8敲除的胚胎干细胞与未经敲除的干细胞相比，其倍增时间显著增长，并且对体外分化刺激没有反应，提示miRNA很可能在细胞增殖与分化中具有重要作用。与Dicer敲除胚胎干细胞相似[35]，DGCR8敲除胚胎干细胞中缺失大部分成熟microRNA，这进一步证实DGCR8在大多数microRNA成熟过程中的重要作用。 (A) miRNA由基因组中某个基因座位转录生成具有5’端帽子结构和多聚腺苷酸尾巴的pri-miRNA。之后在Drosha/DGCR8作用下加工成为pre-miRNA，再经Exportin-5转运至细胞质。pre-miRNA经过Dicer的进一步剪切形成成熟miRNA，miRNA再与RISC以不完全互补的方式结合。(B) 相反，shRNA则自外源导入的DNA转录为类似pre-miRNA的分子，因此不需经过Drosha/DGCR8的加工。之后，与miRNA一样，shRNA经Exportin-5转运至细胞质，在细胞质内经Dicer切割去除环状结构，双链中的一条以完全互补形式与RISC结合。(C) 对于哺乳动物，siRNA则由人工转染进入细胞质，然后与RISC结合。进一步的详细信息请参见文章。 Mirtron(见文后小词典)是intronic microRNA中一个特别的类别，不需要经过microprocessor的剪切。Mirtron通过自身拼接反应形成pre-miRNA。通常经microprocessor的剪切而形成的pre-miRNA的末端是由剪接受体(splice acceptor)与供体位点(donor site)构成的。据此，从逻辑上讲，在mirtron的生物合成过程中，套索结构(lariat structure)的“解套”也是必需的[36,37]。研究者已经利用计算机鉴定出许多哺乳动物体内的mirtron，这些mirtron很明显是从果蝇和线虫体内的mirtron进化而来的[38]。与mirtron不同的是，即使寄主intronic的剪切因其自身剪切位点突变而受阻时，intronic miRNA仍然可以被有效加工，反过来讲，miRNA加工过程受抑也不会影响mRNA的剪切[39]。 Pre-miRNA借助RanGTP依赖性Exportin-5，从核内转运至胞质[40,41]。在细胞质内，pre-miRNA经Dicer剪切，成为成熟的、大约21至23个核苷酸长度的链，Dicer是一种RNase III家族的酶[42]。Dicer与dsRNA分子相结合形成的晶体结构显示，Dicer PAZ(Piwi-Argonaute-Zwille)结构域是与dsRNA分子的末端相结合的，据此可以得知，RNase III酶结构域位于距离RNA双链末端大约25个核苷酸处[43]。与Drosha相同，Dicer切割后所得的RNA片段都有3’端两个碱基的突出和5’端的磷酸基团[42,44]。由于Dicer剪切位点由之前的Drosha剪切位点决定，因此可以说Drosha通过间接的方式决定了成熟miRNA的最终序列。 有空的话可以去生物帮那里详细的了解，那里整合了技术文档、技术视频、行业新闻资讯等相关信息，比较专业。可以看下 www.bio1000.com/zt/rna/221892.html 应该可以详细的了解。

miRNA 真正靶基因的可能性有多大miRNA基因通常是在核内由RNA聚合酶II(polII)转录的,最初产物为大的具有帽子结构(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的pri-miRNA.pri-miRNA在核酸酶Drosha和其辅助因子Pasha的作用下被处理成70个核苷酸组成的pre-miRNA.RAN–GTP和exportin 5将pre-miRNA输送到细胞质中.随后,另一个核酸酶Dicer将其剪切产生约为22个核苷酸长度的miRNA:miRNA*双链.这种双链很快被引导进入沉默复合体(RISC)复合体中,其中一条成熟的单链miRNA保留在这一复合体中.成熟的miRNA结合到与其互补的mRNA的位点通过碱基配对调控基因表达. 与靶mRNA不完全互补的miRNA在蛋白质翻译水平上抑制其表达（哺乳动物中比较普遍）.然而,最近也有证据表明,这些miRNA也有可能影响mRNA的稳定性.使用这种机制的miRNA结合位点通常在mRNA的3’端非编码区.如果miRNA与靶位点完全互补（或者几乎完全互补）,那么这些miRNA的结合往往引起靶mRNA的降解(在植物中比较常见).通过这种机制作用的miRNAs的结合位点通常都在mRNA的编码区或开放阅读框中.每个miRNA可以有多个靶基因,而几个miRNAs也可以调节同一个基因.这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达,也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达.随着miRNA调控基因表达的研究的逐步深入,将帮助我们理解高等真核生物的基因组的复杂性和复杂的基因表达调控网

1，来源不同：miRNA本来就是细胞和生物体内存在的，内源性的，siRNA是外源性的，人工合成的，或者被Dicer酶切割而成的。2，作用的方式不同：miRNA是与它调控的靶基因3'UTR结合，从而使mRNA无法进行翻译，而起到下调基因表达量的作用，而人工设计合成的siRNA，一般很多位点都可以设计，就不是与3'UTR结合了，一般就是沉默它的CDS区。3，数量不同：一般一个靶基因对应的miRNA是少量的，甚至没有，但siRNA理论上就要多很多了，大量的位点都可以设计合成siRNA,只是干扰效果不同，一般要筛选出有效的靶点，miRNA不存在筛选靶点之说。4，结构不同，一般化学合成的siRNA是双链，体内的成熟体miRNA是单链。5，关于应用：miRNA在体内就是存在的，某些也与疾病肿瘤有关，所以是很好的标志物，对于临床诊断有莫大的前景，siRNA因为本来人体就不存在，所以没有诊断的应用，但对于疾病的治疗还是有前景的，只是不那容易找到合适的靶点和传输系统，所以前景并不乐观。

microRNAs（miRNA）是一种大小约21-23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链），但是和siRNA密切相关。据推测，这些非编码小分子RNA（miRNA）参与调控基因表达，但其机制区别于siRNA接到的mRNA降解。第一个被确认的miRNA是在线虫中发现的lin－4和let－7，随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNA。miRNA有高等生物基因组编码,通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体（RISC）降解mRNA或阻碍其翻译。其在物种进化总相当保守，在植物、动物和真菌中发现的miRNAs只在特定的组织和发育阶段表达，miRNA组织特异性和时序性，决定组织和细胞的功能特异性，表明miRNA在细胞生长和发育过程的调节过程中其多种作用。

成熟过程的调节各异,因此成簇的microRNA成熟体的表达量略有不同Piwi蛋白是Argonaute蛋白家族的一个亚家族,它通过与一类跟精子发生有关的小RNA的相互作用来调控基因的表达。Piwi蛋白参与干细胞的自我调控及精子的发生。对Piwi蛋白的研究有利于我们阐明该蛋白的生物学功能,也能促进对piRNA(Piwi-interacting RNA)的了解。我们利用生物信息学同源搜索的方法在昆虫基因组中搜索piwi的同源基因。利用EST延伸技术以及最新版本的GENSCAN软件预测基因的结构,进一步拼接出基因的全长或部分cDNA序列。通过比较基因结构,我们发现脊椎动物和无脊椎动物中的Piwi蛋白的外显子数目之间存在差异,哺乳动物的piwi基因含有20个外显子,而昆虫只有6-9个。我们推测Piwi蛋白在进化过程中可能发生了内含子丢失或获得的事件。

miRNA基因通常是在核内由RNA聚合酶II(polII)转录的,最初产物为大的具有帽子结构(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的pri-miRNA.pri-miRNA在核酸酶Drosha和其辅助因子Pasha的作用下被处理成70个核苷酸组成的pre-miRNA.RAN–GTP和exportin 5将pre-miRNA输送到细胞质中.随后,另一个核酸酶Dicer将其剪切产生约为22个核苷酸长度的miRNA:miRNA*双链.这种双链很快被引导进入沉默复合体(RISC)复合体中,其中一条成熟的单链miRNA保留在这一复合体中.成熟的miRNA结合到与其互补的mRNA的位点通过碱基配对调控基因表达. 与靶mRNA不完全互补的miRNA在蛋白质翻译水平上抑制其表达（哺乳动物中比较普遍）.然而,最近也有证据表明,这些miRNA也有可能影响mRNA的稳定性.使用这种机制的miRNA结合位点通常在mRNA的3’端非编码区.如果miRNA与靶位点完全互补（或者几乎完全互补）,那么这些miRNA的结合往往引起靶mRNA的降解(在植物中比较常见).通过这种机制作用的miRNAs的结合位点通常都在mRNA的编码区或开放阅读框中.每个miRNA可以有多个靶基因,而几个miRNAs也可以调节同一个基因.这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达,也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达.随着miRNA调控基因表达的研究的逐步深入,将帮助我们理解高等真核生物的基因组的复杂性和复杂的基因表达调控