mirna研究方法

木薯(Manihot esculenta Crantz)属于大戟科木薯属植物，典型的热带作物。低温是木薯获得高产优质的限制因子，microRNA(miRNA)作为逆境胁迫诱导的主要调控因子之一在木薯抗寒机制中占有重要地位。miRNA是一类长度约为21～25nt的非编码小RNA，它能识别特定的靶mRNA并在转录及转录后水平有负调控基因的作用。本研究旨在通过表型鉴定方法和分子生物学技术相结合共同探讨木薯抗寒基因的调控机理。通过对术薯C4和SC124品种在低温胁迫处理下的形态生理指标监测和7个miRNA及4个靶基因的实时定量表达分析和功能分析，得出如下结论：(1)在低温胁迫处理下，木薯的叶片数、叶绿素含量、脯氨酸含量和丙二醛含量变化显著，且这些指标变化与木薯叶片出现的冷害褐斑及叶片萎蔫程度等表型变化相一致。低温驯化(AH)和非低温驯化(NAH)的各项指标表明低温驯化能增强木薯的低温适应能力及恢复能力；同时也证实了C4比SC124具有更强的耐寒性。(2)实时定量分析表明木薯中的7个miRNA受低温诱导表达，且它们在C4，和SC124品种中及不同的低温处理方式下都具有差异表达；其中2个miRNA(miRNA1045125和miRNA3747522)的靶基因在两品种和不同低温处理方式下也具有差异表达。(3)通过对2个miRNA和它们靶基因的定量表达分析发现，无论在C4和SC124品种中还是不同低温处理条件下，2个miRNA与它们的靶基因之间都有明显的此消彼长的负调控作用；且4个靶基因在两个品种之间具有相反的表达模式。(4)将miRNA1045125和miRNA3747522的4个靶基因在拟南芥和蓖麻基因组数据库中进行比对，它们在拟南芥和蓖麻中的主要功能是解旋酶、核酸酶、运载蛋白等。

miRNA通过与转录本的相互作用，关闭或抑制基因的表达。最近的研究表明它们影响了约三成的基因。miRNA在多个组织中差异表达，这就让表达图谱分析成为研究的重点。同时，miRNA的过表达和抑制也是近年来常用的研究方法。然而，Peng Jin(埃默里大学)我们使用RNA oligo和载体的方法。对于RNA oligo方法，我们采用类似siRNA双链的miRNA，及anti-miRNA来增加或阻断特定miRNA的活性。这种方法便于操控细胞培养中特定miRNA的活性。载体方法有着长期改变的优势，能够追踪个别细胞。我们利用人工的shRNA质粒或Pol II表达载体，来过表达特定的miRNA。对于miRNA的下调，我们要么表达一个shRNA，它能产生与miRNA前体的茎环结构互补的siRNA，要么使用miRNA海绵(miRNA sponge)，它能在特定miRNA的多个目标位点表达报告基因。Winston Kuo(哈佛大学)目前有两种通用策略：1) 基于载体或病毒的miRNA或miRNA反义链序列的过表达;2) 外源miRNA双链或反义抑制剂的转染。方法的选择取决于实验的设计。一般说来，我们倾向于外源试剂的转染。载体/病毒的策略还依赖Drosha/Dicer酶对转录本的顺序加工，且必须通过Exportin 5从核中输出。在人类癌细胞系中曾报道过Drosha和Dicer水平的miRNA加工缺陷。此外，Exportin 5也被认为是细胞和小鼠模型中miRNA生物发生途径的瓶颈。外源过表达可饱和Exportin 5，从而胜过内源小RNA序列。极端的情况下会引起细胞或动物死亡。外源双链转染后，直接进入RISC复合物中，因而绕过了这些陷阱。当然，在需要持久的功能获得或功能丧失时，还需要载体或病毒的稳定表达。稳定的细胞系必须小心地建立，采用病毒滴度测定来避免上述问题。Joshua Mendell(约翰霍普金斯大学)对于miRNA的上调，我们常常构建表达载体。制备起来非常简单。我们只是扩增miRNA发夹结构及一些侧翼序列，并直接克隆PCR产物。有时候，我们也用合成的miRNA模拟物来瞬时转染细胞，以过表达miRNA。为了抑制miRNA，我们一般使用市场上的反义寡核苷酸。我们使用Dharmacon和Exiqon的抑制剂都获得了成功。这些试剂的局限在于它们只能瞬时作用。为了实现稳定抑制，我们开始用所谓的miRNA海绵。它们实际上是有着多个miRNA结合位点的捕获转录本，能隔离细胞中有活性的miRNA。Silvia Monticelli(瑞士生物医学研究所)我们主要使用慢病毒或反转录病毒系统，因为我们主要研究原代细胞，而且需要长时间的持续表达。取决于细胞类型，我们也使用lipofectamine或Amaxa来瞬时转染。对于下调，我们正使用miRNA海绵。对于短期研究，miRNA抑制剂的瞬时转染效果也很好。Galina Gabriely(哈佛大学)为了评估处理后miRNA的活性，我们测定了与miRNA结合位点融合的萤光素酶的表达。不过，评估miRNA活性的最佳方法是评估它的天然靶点的表达(如果miRNA靶点已知)。这可以通过western blot分析来进行。miRNA表达的调节可用northern blot分析来评估miRNA的表达水平。在某些情况下，定量RT-PCR也能给出miRNA表达的可靠结果，但miRNA调节所使用的寡核苷酸会在PCR反应中干扰引物，从而影响真实的表达数据。Winston Kuo(哈佛大学)我们使用几种策略，包括miRNA qPCR，miRNA northern blot，萤光素酶报告分析，mRNA靶点的qPCR，以及蛋白靶点的western blot。在上面我已经讨论了miRNA qPCR和northern blotting。这些能够直接检测miRNA过表达或下调。萤光素酶报告分析包括3’-UTR序列克隆在萤光素酶编码序列的下游。这些3’-UTR包含了人工的miRNA同源位点或已验证mRNA靶点的内源序列。后一个策略中的关键对照是生成假定同源位点上种子序列的点突变。这些点突变将使miRNA不能调节萤光素酶的表达。Joshua Mendell(约翰霍普金斯大学)为了验证miRNA上调，我们还是使用northern blotting或实时定量PCR来测定miRNA的丰度。测定miRNA的抑制就没那么简单。反义oligo确实降低了miRNA的丰度。因此，你也可以用同样的方法来监控miRNA抑制。不过，体内miRNA的隔离不会总是让miRNA丰度下降。另一个方法是用报告基因重组子来监控miRNA的抑制。miRNA会抑制报告基因的表达，除非它的活性受阻。当然，这种报告基因的使用一般受限于细胞培养环境。Silvia Monticelli(瑞士生物医学研究所)这些实验中的关键一步是：通过转染或转导细胞，你有效地改变了它们，因此你的确需要很多对照，来确认你所看到的结果是来自miRNA的表达或下调。这对miRNA尤其重要，因为在很多情况下，你并不期待一个强的表型，但是你在寻找微调基因表达的温和效果。我想你至少需要目的miRNA之外的miRNA和种子区域的突变体。我还推荐使用不同方法来设法获得相同的结果。

　　miRNA通过与转录本的相互作用，关闭或抑制基因的表达。最近的研究表明它们影响了约三成的基因。miRNA在多个组织中差异表达，这就让表达图谱分析成为研究的重点。同时，miRNA的过表达和抑制也是近年来常用的研究方法。　　然而，　　Peng Jin（埃默里大学）　　我们使用RNA oligo和载体的方法。对于RNA oligo方法，我们采用类似siRNA双链的miRNA,及anti-miRNA来增加或阻断特定miRNA的活性。这种方法便于操控细胞培养中特定miRNA的活性。　　载体方法有着长期改变的优势，能够追踪个别细胞。我们利用人工的shRNA质粒或Pol II表达载体，来过表达特定的miRNA.对于miRNA的下调，我们要么表达一个shRNA,它能产生与miRNA前体的茎环结构互补的siRNA,要么使用miRNA海绵（miRNA sponge），它能在特定miRNA的多个目标位点表达报告基因。　　Winston Kuo（哈佛大学）　　目前有两种通用策略：1） 基于载体或病毒的miRNA或miRNA反义链序列的过表达；2） 外源miRNA双链或反义抑制剂的转染。方法的选择取决于实验的设计。　　一般说来，我们倾向于外源试剂的转染。载体/病毒的策略还依赖Drosha/Dicer酶对转录本的顺序加工，且必须通过Exportin 5从核中输出。在人类癌细胞系中曾报道过Drosha和Dicer水平的miRNA加工缺陷。此外，Exportin 5也被认为是细胞和小鼠模型中miRNA生物发生途径的瓶颈。外源过表达可饱和Exportin 5,从而胜过内源小RNA序列。极端的情况下会引起细胞或动物死亡。外源双链转染后，直接进入RISC复合物中，因而绕过了这些陷阱。　　当然，在需要持久的功能获得或功能丧失时，还需要载体或病毒的稳定表达。稳定的细胞系必须小心地建立，采用病毒滴度测定来避免上述问题。　　Joshua Mendell（约翰霍普金斯大学）　　对于miRNA的上调，我们常常构建表达载体。制备起来非常简单。我们只是扩增miRNA发夹结构及一些侧翼序列，并直接克隆PCR产物。有时候，我们也用合成的miRNA模拟物来瞬时转染细胞，以过表达miRNA.　　为了抑制miRNA,我们一般使用市场上的反义寡核苷酸。我们使用Dharmacon和Exiqon的抑制剂都获得了成功。这些试剂的局限在于它们只能瞬时作用。为了实现稳定抑制，我们开始用所谓的miRNA海绵。它们实际上是有着多个miRNA结合位点的捕获转录本，能隔离细胞中有活性的miRNA.　　Silvia Monticelli（瑞士生物医学研究所）　　我们主要使用慢病毒或反转录病毒系统，因为我们主要研究原代细胞，而且需要长时间的持续表达。取决于细胞类型，我们也使用lipofectamine或Amaxa来瞬时转染。对于下调，我们正使用miRNA海绵。对于短期研究，miRNA抑制剂的瞬时转染效果也很好。　　Galina Gabriely（哈佛大学）　　为了评估处理后miRNA的活性，我们测定了与miRNA结合位点融合的萤光素酶的表达。不过，评估miRNA活性的最佳方法是评估它的天然靶点的表达（如果miRNA靶点已知）。这可以通过western blot分析来进行。miRNA表达的调节可用northern blot分析来评估miRNA的表达水平。在某些情况下，定量RT-PCR也能给出miRNA表达的可靠结果，但miRNA调节所使用的寡核苷酸会在PCR反应中干扰引物，从而影响真实的表达数据。　　Winston Kuo（哈佛大学）　　我们使用几种策略，包括miRNA qPCR,miRNA northern blot,萤光素酶报告分析，mRNA靶点的qPCR,以及蛋白靶点的western blot.在上面我已经讨论了miRNA qPCR和northern blotting.这些能够直接检测miRNA过表达或下调。萤光素酶报告分析包括3'-UTR序列克隆在萤光素酶编码序列的下游。这些3'-UTR包含了人工的miRNA同源位点或已验证mRNA靶点的内源序列。后一个策略中的关键对照是生成假定同源位点上种子序列的点突变。这些点突变将使miRNA不能调节萤光素酶的表达。　　Joshua Mendell（约翰霍普金斯大学）　　为了验证miRNA上调，我们还是使用northern blotting或实时定量PCR来测定miRNA的丰度。测定miRNA的抑制就没那么简单。反义oligo确实降低了miRNA的丰度。因此，你也可以用同样的方法来监控miRNA抑制。不过，体内miRNA的隔离不会总是让miRNA丰度下降。另一个方法是用报告基因重组子来监控miRNA的抑制。miRNA会抑制报告基因的表达，除非它的活性受阻。当然，这种报告基因的使用一般受限于细胞培养环境。　　Silvia Monticelli（瑞士生物医学研究所）　　这些实验中的关键一步是：通过转染或转导细胞，你有效地改变了它们，因此你的确需要很多对照，来确认你所看到的结果是来自miRNA的表达或下调。这对miRNA尤其重要，因为在很多情况下，你并不期待一个强的表型，但是你在寻找微调基因表达的温和效果。我想你至少需要目的miRNA之外的miRNA和种子区域的突变体。我还推荐使用不同方法来设法获得相同的结果。

归一化 microRNA芯片采用的归一化的方法为quantile normalization，loess normalization。 差异基因筛选 microRNA的差异筛选，同表达谱的筛选方法是一致的，参见表达谱的差异基因筛选。 miRNA靶基因预测 microRNA结合在靶基因的3’ UTR，下调靶基因．miRNA靶基因预测有多种方法．我们利用TargetScan数据库关联microRNA的靶基因。 4. miRNA与靶基因网络图     将显著性功能与显著性Pathway所包含的靶基因取交集后与microRNA构建基因与microRNA调控网络（待确认），可以在全局的水平上直观的反应基因之间的相互关系，同时反映了基因调控网络的稳定性。根据网络中microRNA的位置函数计算出microRNA在网络中的关系强度，即microRNA的网络特征值。特征值最高microRNA处于网络的枢纽性地位，该microRNA调控能力最强，对网络结构和样本性状有重要的调控价值，同时从网络中也可以得到被microRNA调控的关键靶基因。5. miRNA－GO　Network miR-GO Network利用靶基因的功能注释与microRNA-mRNA靶向调控关系，构建microRNA功能调控的网络图。网络图可发现MicroRNA调控的多种基因功能，并通过网络分析，得到核心调控microRNA以及microRNA调控的核心基因功能。 6. miRNA－Pathway Network miR- Pathway Network与miR-GO Network类似．利用靶基因的Pathway间相互作用关系，与microRNA-mRNA靶向调控关系，构建miR- Pathway调控的网络图。网络图可发现MicroRNA调控的多种信号通路，并通过网络分析，得到核心调控microRNA以及microRNA调控的核心信号通路。7. miRNA的转录因子的预测 为了研究miRNA的调控机制，首先预测miRNA的promoter区域，根据miRNA的promoter区域，利用HMM来预测结合的转录因子。 8. miRNA与表达谱芯片平台的联合分析 miRNA与表达谱芯片平台的联合分析除了和甲基化与表达谱芯片分析类似外，还可以将miRNA预测的靶基因和表达谱芯片的差异基因取交集，进行miRNA-DiffGene-Network。

microRNAs（miRNA）是一种大小约21-23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链），但是和siRNA密切相关。据推测，这些非编码小分子RNA（miRNA）参与调控基因表达，但其机制区别于siRNA接到的mRNA降解。第一个被确认的miRNA是在线虫中发现的lin－4和let－7，随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNA。miRNA有高等生物基因组编码,通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体（RISC）降解mRNA或阻碍其翻译。其在物种进化总相当保守，在植物、动物和真菌中发现的miRNAs只在特定的组织和发育阶段表达，miRNA组织特异性和时序性，决定组织和细胞的功能特异性，表明miRNA在细胞生长和发育过程的调节过程中其多种作用。microRNAs的作用机制miRNA是一类多细胞动物或植物基因组的前体mRNA内含子，miRNA独立转录单位或miRNA基因簇编码的19-25个核苷酸大小的内源性单链RNA，他们在转录后水平沉默特定基因从而对生物体基因表达起到精细调节的作用[1]。绝大多数miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下形成较长的茎环结构，称为初级miRNA（primary miRNA ,pri- miRNA）。pri- miRNA在Drosha-DGCR8复合体的作用下形成长度约60-70个核苷酸的发夹状RNA，成为前体miRNA（precursor miRNA,pre-miRNA)。随后，pre- miRNA在Exprotin－5复合物[2]的作用下被转运出胞核，在胞浆中由Dicer剪切成为miRNA复合体， miRNA复合物（RNA－inced silencing comlex，RISC）[1]与该miRNA的3’翻译区（3’UTR）结合到位于胞浆的P－body（processing bady）中[3]：如果miRNA与靶mRNA匹配完全，则该复合体降解mRNA；若两者序列部分匹配，尤其是miRNA的5’端2-8个被称为种子序列（seed sequence）的核苷酸与靶mRNA匹配完好，则通过抑制靶mRNA的翻译来沉默特定基因。此外，某些miRNA，如miRNA－16能够特异结合于某些基因3’UTA的富含AU元件（AU rich element,ARE）,指导Ago等组成RISC区的蛋白与TTP结合，从而改变相应mRNA的半衰期，加速靶mRNA的降解。此外，miRNA也可能抑制5’UTR含有内部核糖体进入位点（intrnal ribosome entry sites,IRESs）的靶标分子[4]。miRNA的表达调控机制①顺时调控元件 大多数miRNA基因的核心启动子区域含有TA盒，并且含有影响miRNA表达的细胞特异转录调节元件。miRNAs作为转录因子重要的靶分子在细胞功能调控中发挥核心作用。②表观遗传学 最近一些研究提示，表观遗传学变化会影响miRNA 基因，从而调节miRNA表达。分析基于miRNAse（release 8.0）数据库的332个人miRNA基因序列时，发现其中155个miRNA的基因序列上游或下游2000bp处含有CG岛在miR-127[6],miR-24a[6],let-7a-3[7]和miR－370[8]基因中，均含有CpG岛，并且在相应地肿瘤组织中呈现高度甲基化，这些miRNA在肿瘤中的甲基化沉默将导致他们的靶基因－原癌基因（BCL6，CDK6和MAP3K8等）的表达，从而促进肿瘤发育。转录因子PRDM5可能参与了调解miRNAs基因的表观遗传学变化。在HEK293细胞中，PRDM5可以募集蛋白甲基化转移酶G9a和一类组蛋白去乙酰基酶等组蛋白修饰到has－mir－135b基因的启动子区域，行使抑制功能[9],miRNA在癌症细胞中的表达一般低于正常组织细胞，这表明多数miRNAs可能作为肿瘤抑制因子而发挥作用。原癌基因的低度甲基化和肿瘤抑制基因的高度甲基化被认为是癌症表观遗传学的主要决定因素。miRNAs基因在肿瘤中的异常甲基化使表观遗传学调控癌症机理更加复杂。③单核苷酸多态性 存在于pri－mRNAs，pri－mRNA或成熟miRNAs基因序列中的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）能够潜在地影响miRNA调节的细胞功能网络。miRNA基因或靶结合位点及其临近靶位点区域的多态变化时，于miRNA的生物合成及靶位点选择和抑制效应据重要的意义。④RNA编辑 （RNA editing）是基因在初级转录物上增删或取代某些核苷酸而改变遗传信息的过程，从而可调节基因的表达。RNA编辑在miRNA调控基因默过程中其重要作用，不仅影响miRNA表达，而且影响特异miRNA的靶向分子的调控。此外，At编辑也有可能存在于靶分子的种子互补区域。

最近进行课题设计，想验证一下microRNA和预测的靶基因是否结合。同时在靶基因3‘-UTR区的SNP是否影响它们的关系。这个SNP位点在种子区，推测也具有一定功能。第一步想克隆microRNA到表达载体，同时克隆3’-UTR区（包括野生型和突变型）到PGL-3 control 荧光素酶基因下游，双转细胞后，利用荧光素酶报告系统检测两者是否结合，snp位点是否影响结合。 请问具体的实验设计： 1.选取什么细胞系进行实验，是靶基因和miRNA内源表达高的，还是低的。细胞系的基因型是否影响实验结果？ 2.我选用的载体是否合适，miRNA如果已有慢病毒的表达载体（商品），是否可以直接利用，还是需要重新做？PGL-3 control是否可以？有无合适的位点供克隆，只发现XbaI。内对照用PGL-TK,因为不是很熟悉这套载体，不知选的是否合适。 3.如果验证成功，还需什么实验佐证，后续的功能研究如何进行？是否也需要用RNAi的方法抑制靶基因表达，再转入野生型和突变性两种基因，看效果？ 这个感觉难度较大，也是第一次接触这方面的课题，希望得到诸位高手的指点，谢谢！

在NCBI主页输入要查找的miRNA的名称，all database中选择GENE；在搜索结果中选择目的miRNA，在NCBI reference sequences（RefSeq）栏中点击目的miRNA的ID号即转到序列，还可以通过链接到UCSC、miRBase查找不用给加分了。我要是你，先上CKNI或万方查找中文相关综述性文章，看完之后了解到本研究的几个关键词，再上scholar.Google.com.hk或者是Scopus这样的数据库，查找英文相关文章，多看几篇自然就都明白了。

可以从一下几个方面入手：通过查阅文献得知该基因的生物学意义或者存在的临床意义，这个研究一个基因的灵魂，好的基因选择会使后续结果事半功倍，研究有意义的基因是我们开展实验的首选。基因组层面：可以研究DNA甲基化水平的影响，一般是和启动子区域结合起来分析，此为表观遗传学范畴。用以研究甲基化水平高低对某种疾病的作用，从而找到相对关联RNA水平就可以考虑RNA甲基化水平或者RNA与蛋白之间的互作关系，比如5mC，m6A,MIRIP等当然还可以通过转录组测序分析整体的结果，比如miRNA-seq,mRNA-seq，全转录组测序，通过筛选出靶基因然后进行下游验证。细胞功能试验如基因敲除后的cck8，transwell等等，研究各个基因间的互作关系，建立关联信息，当然还可以对细胞功能后的样本进行重测组研究其他的基因。wb实验研究蛋白层面的相对变化，或者是进行质谱分析。当然如果还想深入的研究，也可以在细胞功能层面去研究外泌体等信息，通过测序或者细胞功能实验等都是可以的。从此看出研究一个基因的方法还是很多的，从上游到下游，都有非常成熟的技术加一辅助，但期间最重要的是我们的前期调研以及合适的实验方案，实验对象，实验思路，实验方法，这些决定了我们的研究的最终结果。

（1）癌细胞在适宜的条件下具有无限增值的特征，根据题干“miRNA-375这种不能编码蛋白质的小RNA，在胰腺癌细胞中的合成量显著低于正常细胞”，推测本研究以期从分子水平研究治疗癌症的新方法．（2）以miRNA-375为模板合成DNA时，属于逆转录过程，故需逆转录酶催化．（3）对比图1A、B显示的结果，可看出经过相同的培养时间，A组细胞的数量显著少于B组，故说明miRNA-375的合成量增加会导致细胞增殖受到抑制．图2显示的结果是：A组处于分裂间期期的细胞比例明显增大，故使得细胞的DNA复制受抑制．（4）研究显示，A组细胞的凋亡率较B组明显增加，故可得出miRNA-375可诱导细胞凋亡．（5）为排除导入质粒对实验结果产生的影响，故实验设置了导人未经重组的质粒的C组．故答案为：（1）无限增值 分子（2）逆转录（3）经过相同的培养时间，A组细胞的数量显著少于B组 细胞增殖受到抑制 A 分裂间期（4）细胞凋亡（5）排除导入质粒对实验结果产生的影响