microrna研究方法

现行的实验方案中，测序，northern blot，芯片，荧光定量实验，荧光原位杂交实验等比较常用。

最近进行课题设计，想验证一下microRNA和预测的靶基因是否结合。同时在靶基因3‘-UTR区的SNP是否影响它们的关系。这个SNP位点在种子区，推测也具有一定功能。第一步想克隆microRNA到表达载体，同时克隆3’-UTR区（包括野生型和突变型）到PGL-3 control 荧光素酶基因下游，双转细胞后，利用荧光素酶报告系统检测两者是否结合，snp位点是否影响结合。 请问具体的实验设计： 1.选取什么细胞系进行实验，是靶基因和miRNA内源表达高的，还是低的。细胞系的基因型是否影响实验结果？ 2.我选用的载体是否合适，miRNA如果已有慢病毒的表达载体（商品），是否可以直接利用，还是需要重新做？PGL-3 control是否可以？有无合适的位点供克隆，只发现XbaI。内对照用PGL-TK,因为不是很熟悉这套载体，不知选的是否合适。 3.如果验证成功，还需什么实验佐证，后续的功能研究如何进行？是否也需要用RNAi的方法抑制靶基因表达，再转入野生型和突变性两种基因，看效果？ 这个感觉难度较大，也是第一次接触这方面的课题，希望得到诸位高手的指点，谢谢！

最近进行课题设计，想验证一下microRNA和预测的靶基因是否结合。同时在靶基因3‘-UTR区的SNP是否影响它们的关系。这个SNP位点在种子区，推测也具有一定功能。第一步想克隆microRNA到表达载体，同时克隆3’-UTR区（包括野生型和突变型）到PGL-3 control 荧光素酶基因下游，双转细胞后，利用荧光素酶报告系统检测两者是否结合，snp位点是否影响结合。请问具体的实验设计：1.选取什么细胞系进行实验，是靶基因和miRNA内源表达高的，还是低的。细胞系的基因型是否影响实验结果？2.我选用的载体是否合适，miRNA如果已有慢病毒的表达载体（商品），是否可以直接利用，还是需要重新做？PGL-3 control是否可以？有无合适的位点供克隆，只发现XbaI。内对照用PGL-TK,因为不是很熟悉这套载体，不知选的是否合适。3.如果验证成功，还需什么实验佐证，后续的功能研究如何进行？是否也需要用RNAi的方法抑制靶基因表达，再转入野生型和突变性两种基因，看效果？最近进行课题设计，想验证一下microRNA和预测的靶基因是否结合。同时在靶基因3‘-UTR区的SNP是否影响它们的关系。这个SNP位点在种子区，推测也具有一定功能。第一步想克隆microRNA到表达载体，同时克隆3’-UTR区（包括野生型和突变型）到PGL-3 control 荧光素酶基因下游，双转细胞后，利用荧光素酶报告系统检测两者是否结合，snp位点是否影响结合。请问具体的实验设计：1.选取什么细胞系进行实验，是靶基因和miRNA内源表达高的，还是低的。细胞系的基因型是否影响实验结果？2.我选用的载体是否合适，miRNA如果已有慢病毒的表达载体（商品），是否可以直接利用，还是需要重新做？PGL-3 control是否可以？有无合适的位点供克隆，只发现XbaI。内对照用PGL-TK,因为不是很熟悉这套载体，不知选的是否合适。3.如果验证成功，还需什么实验佐证，后续的功能研究如何进行？是否也需要用RNAi的方法抑制靶基因表达，再转入野生型和突变性两种基因，看效果？这个感觉难度较大，也是第一次接触这方面的课题，希望得到诸位高手的指点，谢谢！本回答被提问者和网友采纳

Small RNA是一大类调控分子，几乎存在于所有的生物体中。Small RNA包括：miRNA、ncRNA、siRNA、snoRNA、piRNA、rasiRNA等等。Small RNA通过多种多样的作用途径，包括mRNA降解、翻译抑制、异染色质形成以及DNA去除，来调控生物体的生长发育和疾病发生。Small RNA转录组测序是鉴定和定量解析small RNA的新方法和有力工具。Roche GS FLX Titanium 、Illumina Solexa GA IIx和AB SOLID 4均可以对Small RNA进行大规模测序分析， Illumina Solexa GA IIx 和ABI Solid的读长正好配合了small RNA的短序列且通量大，可以得到更高的覆盖率， Illumina Solexa GA IIx在small RNA测序中广泛应用。通过对Small RNA大规模测序分析，可以从中获得物种全基因组水平的Small RNA图谱，实现包括新Small RNA分子的挖掘，其作用靶基因的预测和鉴定、样品间差异表达分析、Small RNA聚类和表达谱分析等科学应用。一、small RNA测序样品要求(1) 样品纯度要求： OD值应在1.8至2.2之间；电泳检测28S:18S至少大于1.5。(2) 样品浓度： total RNA浓度不低于750 ng/μg；提取总RNA时请不要使用过柱法提取总RNA，样品总量不低于40 μg (Small RNA: total RNA大于0.3%)。或提供浓度大于2 ng/μg，总量大于180 ng的Small RNA样品。(3) Small RNA样品请置于-20℃保存；请提供Small RNA样品具体浓度、体积、制备时间、溶剂名称及物种来源。请同时附上QC数据，包括电泳胶图、分光光度或Nanodrop仪器检测数据。如需进行多次样品制备，需要提供多次样品制备所需样品。(4) 样品运输：样品请置于1.5 ml管中，管上注明样品名称、浓度以及制备时间，管口使用Parafilm封口。建议使用干冰运输，并且尽量选用较快的邮递方式，以降低运输过程中样品降解的可能性。二、Small RNA分离的方法现行的RNA纯化方法包括有机溶剂抽提+乙醇沉淀，或者是采用更加方便快捷的硅胶膜离心柱的方法来纯化RNA。由于硅胶膜离心柱通常只富集较大分子的RNA(200 nt以上)，Small RNA往往被淘汰掉，因而不适用于Small RNA的分离纯化。有机溶剂抽提能够较好的保留Small RNA，但是后继的沉淀步骤比较费时费力。目前还有另外一些Small RNA分离专用的试剂盒。如MirVana miRNA Isolation Kit是采用玻璃纤维滤膜离心柱(glass fiber filter，GFF)，既能够富集10 mer以上的RNA分子，又兼备离心柱快速离心纯化的特点。对于Small RNA测序，我们采用PAGE胶电泳对小RNA进行分离。客户可以选择他们感兴趣的Small RNA长度进行研究。Small RNA的长度为18-30nt。我们推荐的测序长度为35bp，之后对序列信息进行修剪，去除接头序列仅留下Small RNA序列。三、Small RNA测序文库的构建方法及质量控制由于Solexa的读长足够满足Small RNA测序的读长要求，且数据读取量大，性价比高，因此Solexa在Small RNA测序方面得到广泛的应用。采用Solexa进行Small RNA测序其文库构建方法如下：(1) PAGE胶纯化特定大小的小RNA分子；(2) 5′接头连接和纯化；(3) 3′接头连接纯化；(4) RT-PCR扩增；(5) Small RNA文库的纯化；(6) 文库的检测。Small RNA文库需要通过电泳检测和Agilent Technoligies 2100 分析仪检测以分析测序文库中片段的大小、纯度和浓度。四、高通量测序研究sRNA 优势目前研究Small RNA的方法主要是通过实时定量PCR以及基因芯片技术，这些方法主要关注microRNA的表达和定量，并仅局限与研究那些序列信息或二级茎环结构信息已知的Small RNA，无法寻找和发现新的Small RNA分子。基于高通量测序技术的Small RNA测序技术突破了目前研究技术手段上的局限性，使研究人员能够直接对样本中的Small RNA进行高通量测序，其主要优势有：(1) 可以直接从核苷酸水平上研究Small RNA分子，不存在传统芯片杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题，非常利于区分相同家族以及序列极为相似的不同Small RNA分子；(2) 可以对任意物种进行高通量分析，无需任何预先的序列信息以及二级结构信息【中国测序论坛】；(3) 灵敏度高，测序通量大，为Small RNA分子的发现和研究提供了极大的数据深度与覆盖率，能够检测丰度极低的稀有转录；(4) 测序产生的原始数据可以与多种分析软件兼容，可以注释Small RNA的基因组信息，并分析其表达水平，能够随时使用公用Small RNA数据库注释已知的Small RNA，还可以进一步分析未匹配的数据，发现新的Small RNA种类及异构体，寻找更深入的研究信息。五、Small RNA测序的影响因素(1) 客户提供样本的质量，进行Small RNA测序过程中，需要对Small RNA进行分离，分离Small RNA的质量和纯度直接影响测序结果。由于RNA容易降解，因此RNA的抽提、纯化等操作一定要严格按照实验要求进行，以保证样品的质量。(2) 构建文库的质量：文库构建需要PAGE胶分离纯化Small RNA，然后连接接头进行纯化后才能进行RT-PCR，在此过程中，要小心操作保证Small RNA无降解，同时纯化过程要保证接头去除干净，残余的接头会对后续的测序产生影响。(3) 测序文库的上样量控制：这个因素也会很大程度影响簇生成的密度，由于上样量非常小，只有1-8 pg，所以能否准确定量微量样品也成为影响测序通量的重要因素。

microRNA芯片和基因表达谱芯片都是芯片. 芯片指样本荧光染色杂交到芯片上,通过各个点亮度差异来判断表达差异的方法. 区别是一个针对microRNA,微小RNA.另一个针对mRNA,信使RNA. microRNA测序区别于芯片分析方法.直接测出小片段的序列然后用生物统计方法合并区段等最终计算出表达差异. microRNA芯片与microRNA测序是用不同平台研究同样的问题.

　　miRNA通过与转录本的相互作用，关闭或抑制基因的表达。最近的研究表明它们影响了约三成的基因。miRNA在多个组织中差异表达，这就让表达图谱分析成为研究的重点。同时，miRNA的过表达和抑制也是近年来常用的研究方法。　　然而，　　Peng Jin（埃默里大学）　　我们使用RNA oligo和载体的方法。对于RNA oligo方法，我们采用类似siRNA双链的miRNA,及anti-miRNA来增加或阻断特定miRNA的活性。这种方法便于操控细胞培养中特定miRNA的活性。　　载体方法有着长期改变的优势，能够追踪个别细胞。我们利用人工的shRNA质粒或Pol II表达载体，来过表达特定的miRNA.对于miRNA的下调，我们要么表达一个shRNA,它能产生与miRNA前体的茎环结构互补的siRNA,要么使用miRNA海绵（miRNA sponge），它能在特定miRNA的多个目标位点表达报告基因。　　Winston Kuo（哈佛大学）　　目前有两种通用策略：1） 基于载体或病毒的miRNA或miRNA反义链序列的过表达；2） 外源miRNA双链或反义抑制剂的转染。方法的选择取决于实验的设计。　　一般说来，我们倾向于外源试剂的转染。载体/病毒的策略还依赖Drosha/Dicer酶对转录本的顺序加工，且必须通过Exportin 5从核中输出。在人类癌细胞系中曾报道过Drosha和Dicer水平的miRNA加工缺陷。此外，Exportin 5也被认为是细胞和小鼠模型中miRNA生物发生途径的瓶颈。外源过表达可饱和Exportin 5,从而胜过内源小RNA序列。极端的情况下会引起细胞或动物死亡。外源双链转染后，直接进入RISC复合物中，因而绕过了这些陷阱。　　当然，在需要持久的功能获得或功能丧失时，还需要载体或病毒的稳定表达。稳定的细胞系必须小心地建立，采用病毒滴度测定来避免上述问题。　　Joshua Mendell（约翰霍普金斯大学）　　对于miRNA的上调，我们常常构建表达载体。制备起来非常简单。我们只是扩增miRNA发夹结构及一些侧翼序列，并直接克隆PCR产物。有时候，我们也用合成的miRNA模拟物来瞬时转染细胞，以过表达miRNA.　　为了抑制miRNA,我们一般使用市场上的反义寡核苷酸。我们使用Dharmacon和Exiqon的抑制剂都获得了成功。这些试剂的局限在于它们只能瞬时作用。为了实现稳定抑制，我们开始用所谓的miRNA海绵。它们实际上是有着多个miRNA结合位点的捕获转录本，能隔离细胞中有活性的miRNA.　　Silvia Monticelli（瑞士生物医学研究所）　　我们主要使用慢病毒或反转录病毒系统，因为我们主要研究原代细胞，而且需要长时间的持续表达。取决于细胞类型，我们也使用lipofectamine或Amaxa来瞬时转染。对于下调，我们正使用miRNA海绵。对于短期研究，miRNA抑制剂的瞬时转染效果也很好。　　Galina Gabriely（哈佛大学）　　为了评估处理后miRNA的活性，我们测定了与miRNA结合位点融合的萤光素酶的表达。不过，评估miRNA活性的最佳方法是评估它的天然靶点的表达（如果miRNA靶点已知）。这可以通过western blot分析来进行。miRNA表达的调节可用northern blot分析来评估miRNA的表达水平。在某些情况下，定量RT-PCR也能给出miRNA表达的可靠结果，但miRNA调节所使用的寡核苷酸会在PCR反应中干扰引物，从而影响真实的表达数据。　　Winston Kuo（哈佛大学）　　我们使用几种策略，包括miRNA qPCR,miRNA northern blot,萤光素酶报告分析，mRNA靶点的qPCR,以及蛋白靶点的western blot.在上面我已经讨论了miRNA qPCR和northern blotting.这些能够直接检测miRNA过表达或下调。萤光素酶报告分析包括3'-UTR序列克隆在萤光素酶编码序列的下游。这些3'-UTR包含了人工的miRNA同源位点或已验证mRNA靶点的内源序列。后一个策略中的关键对照是生成假定同源位点上种子序列的点突变。这些点突变将使miRNA不能调节萤光素酶的表达。　　Joshua Mendell（约翰霍普金斯大学）　　为了验证miRNA上调，我们还是使用northern blotting或实时定量PCR来测定miRNA的丰度。测定miRNA的抑制就没那么简单。反义oligo确实降低了miRNA的丰度。因此，你也可以用同样的方法来监控miRNA抑制。不过，体内miRNA的隔离不会总是让miRNA丰度下降。另一个方法是用报告基因重组子来监控miRNA的抑制。miRNA会抑制报告基因的表达，除非它的活性受阻。当然，这种报告基因的使用一般受限于细胞培养环境。　　Silvia Monticelli（瑞士生物医学研究所）　　这些实验中的关键一步是：通过转染或转导细胞，你有效地改变了它们，因此你的确需要很多对照，来确认你所看到的结果是来自miRNA的表达或下调。这对miRNA尤其重要，因为在很多情况下，你并不期待一个强的表型，但是你在寻找微调基因表达的温和效果。我想你至少需要目的miRNA之外的miRNA和种子区域的突变体。我还推荐使用不同方法来设法获得相同的结果。

根据实际来设计 比较最后中标了 你也要根据这个来做的

关于澳洲或者新西兰的博士的申请，具体的申请流程跟正常申请授课式的课程是有区别的。一般首先需要你自己有明确的研究方向，有自己明确的研究计划，之后根据自己的研究方向，去澳洲或者新西兰的院校的官方网站上去了解哪些学校有相关的项目的导师，你计划3年后去读的话，现在先了解一下院校信息就好，毕竟3年的时间变数还有很多，现在在做的项目3年后未必还在继续。关于奖学金，读博士一般都有机会申请到奖学金的，说白了，博士的奖学金就是你跟导师做项目，导师给你发的工资，具体也要看你自己的研究项目导师是否感兴趣，你是否有研究经验、是否有专业的学术论文发表在专业的刊物上等等，具备了这些条件，在跟导师沟通研究计划的时候，导师同意接受你之后，就可以再跟导师谈奖学金的事情了。是免学费还是给生活补贴，还是既免学费又给生活补贴的方式，就要看导师对你的认可程度了。

基因和microrna有多个结合位点合生基因构建的miRNA sponge抑制载体，经特异地优化设计，增强吸附能力的同时增加了的结合位点，这样提高了成熟miRNA或siRNA抑制能力，消弱细胞中miRNA或siRNA导致的基因沉默效应，从而进行miRNA或siRNA功能缺失性研究。最近进行课题设计，想验证一下microRNA和预测的靶基因是否结合。同时在靶基因3‘-UTR区的SNP是否影响它们的关系。这个SNP位点在种子区，推测也具有一定功能。第一步想克隆microRNA到表达载体，同时克隆3’-UTR区（包括野生型和突变型）到PGL-3 control 荧光素酶基因下游，双转细胞后，利用荧光素酶报告系统检测两者是否结合，snp位点是否影响结合。请问具体的实验设计：1.选取什么细胞系进行实验，是靶基因和miRNA内源表达高的，还是低的。细胞系的基因型是否影响实验结果？2.我选用的载体是否合适，miRNA如果已有慢病毒的表达载体（商品），是否可以直接利用，还是需要重新做？PGL-3 control是否可以？有无合适的位点供克隆，只发现XbaI。内对照用PGL-TK,因为不是很熟悉这套载体，不知选的是否合适。3.如果验证成功，还需什么实验佐证，后续的功能研究如何进行？是否也需要用RNAi的方法抑制靶基因表达，再转入野生型和突变性两种基因，看效果？