代谢组学研究手段

代谢组学的研究方法与蛋白质组学的方法类似，通常有两种方法。一种方法称作代谢物指纹分析 （metabolomic fingerprinting），采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）的方法，比较不同血样中各自的代谢产物以确定其中所有的代谢产物。从本质上来说，代谢指纹分析涉及比较不同个体中代谢产物的质谱峰，最终了解不同化合物的结构，建立一套完备的识别这些不同化合物特征的分析方法。另一种方法是代谢轮廓分析（metabolomic profiling）,研究人员假定了一条特定的代谢途径，并对此进行更深入的研究。对于代谢产物来说，不仅只有质谱峰这个特征。更进一步说，质谱（MS）并不能检测出所有的代谢产物，并不是因为质谱的灵敏度不够，而是由于质谱只能检测离子化的物质，但有些代谢产物在质谱仪中不能被离子化。采用核磁共振（NMR）的方法，可以弥补色谱的不足。剑桥大学的Jules Griffin博士，正在使用质谱与核磁共振结合的方法，试图建立机体中的完整代谢途径图谱。Griffin用核磁共振检测高丰度的代谢产物，由于核磁共振检测的灵敏度不高，所以只用于分析低丰度代谢产物。过去，只有毒理学方面的研究使用核磁共振，而质谱只在植物代谢研究中采用。如今，这两种方法在代谢组学研究中已经普遍使用。为在不同样品间进行有意义的比较，研究人员必须结合使用这两种方法获得的大量数据进行分析。此外，还需要结合基因组学研究获得的数据。Gary Siuzdak博士在美国克利普斯研究院（TSRI）从事生物信息学问题的研究，他设计了一个分析来自不同样品代谢产物变化的实验方案。研究人员可以通过生物信息学软件XEMS比较不同的数据，从而识别出代谢产物。软件提供了所有代谢产物的分子量数据，这些代谢产物浓度因不同的个体而变化。公众可以从网上免费获取这些数据。Siuzdak博士表示，他们正采用综合研究的方法进行代谢组学研究，试图检测出尽可能多的代谢产物，超越人们过去使用方法所能达到的目标。通过个体研究，希望能在一定程度上识别出与应激有关的新分子，这些应激物可能是一种疾病，一种敲除酶，或者是其他的物质。

代谢组学主要研究的是作为各种代谢路径的底物和产物的小分子代谢物（MW<1000）。 在食品安全领域，利用代谢组学工具发现农兽药等在动植物体内的相关生物标志物也是一个热点领域。其样品主要是动植物的细胞和组织的提取液。主要技术手段是核磁共振（NMR），质谱（MS），色谱（HPLC，GC）及色谱质谱联用技术。通过检测一系列样品的NMR 谱图，再结合模式识别方法，可以判断出生物体的病理生理状态，并有可能找出与之相关的生物标志物（biomarker）。为相关预警信号提供一个预知平台。

1、按什么方式验收；2、验收时间；3、验收地点；4、验收时，双方哪些人员大致内容这些，根据自己的实际情况组成验收计划！

代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科，是系统生物学的重要组成部分。之后得到迅速发展并渗透到多项领域，比如疾病诊断、医药研制开发、营养食品科学、毒理学、环境学，植物学等与人类健康护理密切相关的领域。基因组学和蛋白质组学分别从基因和蛋白质层面探寻生命的活动，而实际上细胞内许多生命活动是发生在代谢物层面的，如细胞信号释放（cell signaling），能量传递，细胞间通信等都是受代谢物调控的。代谢组学正是研究代谢组（metabolome）——在某一时刻细胞内所有代谢物的集合——的一门学科。基因与蛋白质的表达紧密相连，而代谢物则更多地反映了细胞所处的环境，这又与细胞的营养状态，药物和环境污染物的作用，以及其它外界因素的影响密切相关。因此有人认为，“基因组学和蛋白质组学告诉你什么可能会发生，而代谢组学则告诉你什么确实发生了。”（Bill Lasley, UC Davis）代谢组学的概念来源于代谢组，代谢组是指某一生物或细胞在一特定生理时期内所有的低分子量代谢产物，代谢组学则是对某一生物或细胞在一特定生理时期内所有低分子量代谢产物同时进行定性和定量分析的一门新学科　(Goodacre，2004)。它是以组群指标分析为基础，以高通量检测和数据处理为手段，以信息建模与系统整合为目标的系统生物学的一个分支。The concept that indivials might have a metabolic profile that could be reflected in the makeup of their biological fluids was introced by Roger Williams in the late 1940s, who used paper chromatography to suggest characteristic metabolic patterns in urine and saliva were associated with diseases such asschizophrenia. However, it was only through technological advancements in the 1960s and 1970s that it became feasible to quantitatively (as opposed to qualitatively) measure metabolic profiles. The term metabolic profile was introced by Horning, et al. in 1971 after they demonstrated that gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) could be used to measure compounds present in human urine and tissue extracts. The Horning group, along with that of Linus Pauling and Arthur B. Robinson led the development of GC-MS methods to monitor the metabolites present in urine through the 1970s.Gates, Sweeley; Sweeley, CC (1978). Quantitative metabolic profiling based on gas chromatography. Clin Chem 24 (10): 1663–73. PMID 359193.Preti, George. Metabolomics comes of age? The Scientist, 19[11]:8, June 6, 2005.Jump up^ Novotny et al.; Soini, Helena A.; Mechref, Yehia (2008). Biochemical indiviality reflected in chromatographic, electrophoretic and mass-spectrometric profiles. J Chromatog B 866: 26–47. doi:10.1016/j.jchromb.2007.10.007.Jump up^ Griffiths W.J., Wang Y. (2009). Mass spectrometry: From proteomics to metabolomics and lipidomics. Chem Soc Rev 38 (7): 1882–96. doi:10.1039/b618553n.PMID 19551169.

基因组：以生物体所有的核酸为研究对象，狭义的基因组定义为生命体的全套DNA，广义的基因组则包含DNA、mRNA、lncRNA等参与到基因表达调控的所有核酸序列。其主要研究手段为基因测序，以华大基因为代表。转录组通常可认为是基因组的简化研究手段，即所有转录本的集合。蛋白组：生物体基因组所编码的全套蛋白质。鉴于蛋白质表达的时空特异性，各组织器官或者特定亚细胞结构器（如线粒体、叶绿体），甚至是外泌蛋白，也可以成为一个蛋白组。所以蛋白质组是信号转导、分子发育最为直接的手段。其主要研究手段为生物质谱，在国内以牟合蛋白为典型。代谢组：生物体内源性代谢物质的动态整体，通常只涉及相对分子质量约小于1000的小分子代谢物质。因其与蛋白质组一样可以很好的指针细胞、机体的生命活动状态，所以常常被用作临床生物标志物的筛选。目前，代谢组的研究也只能借助生物质谱完成。下面这幅图能够很好的呈现基因、代谢、生命活动间的关系:Figure. Genomic-Proteomic-Phenotype

一，转基因风波缘起2009年11月27日，农业部颁发了两种转基因水稻、一种转基因玉米的安全证书，这意味着中国将成为世界上第一个转基因主粮商业化种植的国家。农业部此举在社会上掀起了轩然大波。许多学者上书中央，人大代表、政协委员在两会期间提交关于谨慎对待转基因问题的提案。转基因食品是指利用基因工程（转基因）技术在物种基因组中嵌入了（非同种）外源基因的食品。转基因作为一种新兴的生物技术手段，它的不成熟和不确定性，必然使得转基因食品的安全性成为人们关注的焦点。由农业部批准的我国即将推广种植的转基因水稻就是将细菌中的有毒基因(下称Bt)，插入到水稻的遗传物质DNA中，使水稻自己产生Bt抗虫毒素，杀死以谷物为食的昆虫。二，转基因食品动物实验危害事件（1）英国政府资助的研究显示，食用了转基因土豆的老鼠出现了肝脏癌症早期症状、睾丸发育不全、免疫系统和神经系统部分萎缩等异常现象。（2）德国黑森州北部农民从1997年开始试种Bt-176玉米，并用作奶牛的补充饲料，2000年当农民开始提高该玉米在饲料中的比例后，所有的牛都死亡了。2004年瑞士联邦技术研究院地球植物学研究所海尔比克教授发现，Bt-176中的用来毒杀欧洲玉米螟的Bt毒素，无法分解，最终毒死了奶牛。（3）2006年，俄罗斯科学院高级神经生理研究所科学家伊琳娜艾尔马科娃博士研究发现，食用转基因大豆食物的老鼠，其幼鼠一半以上在出生后头三个星期死亡，是没有食用转基因大豆老鼠死亡率的6倍。(4)绝育是吃转基因食物的动物出现的普遍问题，“印度在哈里亚纳邦的调查表明，大多数吃了转基因棉籽的水牛有并发症，如早产，流产，不育，并子宫脱垂。许多小牛死亡。在美国，大约24个农民报告说成千上万只猪吃了转基因玉米品种后不能生殖或出现假怀孕现象”。三，转基因食品对人体健康的危害 （1）转基因化食品改变了我们所食用食品的自然属性，它所使用的生物物质不是人类食品安全提供的部份，并未进行较长时间的人体安全性试验，这会对人体构成极大的健康危害。 （2）转基因化食品会产生不可预见的生物突变，会在食品中产生较高水平和新的毒素。 （3）过敏或变态反应：基因技术会在食品中产生不能预见的和未知的变态反应原。科学家把巴西胡桃的特性移植到黄豆上去，结果却使一些对胡桃过敏的人在摄取黄豆后有产生过敏性反应的可能。 （4）转基因食品中减少食品的营养价值或降解食品中重要的成份：美国的研究资料表明，在具有抗除草剂基因的大豆中，异黄酮类激素等防癌的成份减少了。基因化食品的虚假新鲜感迷惑消费者,有光泽的红色蕃茄能贮藏几周，但营养价值较低。（5）转基因技术采用耐抗菌素基因来标识转基因化的农作物，这就意味着农作物带有耐抗菌素的基因。这些基因通过细菌而影响我们。英国的研究显示，转基因作物中的突变基因可能会进入到生物体内，其结果可能会导致新的疾病。如果类似结果发生在人和动物体内，就可能培养出功效最强的、抗菌素也无法杀死的超级细菌。（6）副作用能杀害人体：Mayeno,A.N.等（1994）报告，发生一种新的，不明原因的病症，主要表现为嗜酸性肌痛。临床表现有麻痹、神经问题、痛性肿胀、皮肤发痒、心脏出现问题，记忆缺乏、头痛、光敏、消瘦。后查明系日本一公司生产的基因化工程细菌产生的色氨酸所致。食用者在3个月后发病，导致37人死亡，1500人体部份麻痹，5000多人发生偶尔性无力。（7）2007年，法国科学家证实：孟山都公司生产的一种转基因玉米对人体肝脏和肾脏具有毒性。四，世界各国对转基因的态度（1）美国虽是转基因粮食生产大国，可是国内消费转基因食品却极少。其所种植的转基因大豆、玉米在美国本土主要用于动物饲料和生产酒精燃料，再就是出口发展中国家，包括非洲、中国。近期国际先驱导报于7月6日发表文章：《美国全面反思转基因技术》，转基因技术的发明国美国，已经承认了第一代转基因技术的失败，并且认为转基因技术对人类健康和自然环境会构成极大的不确定性危害。（2）欧盟成员国的政府和民众对于转基因作物大部分都采取坚决抵制的态度，2008年至2009年，法国政府、德国、希腊、匈牙利、卢森堡、奥地利下达了禁令，禁止种植转基因作物。（3）俄罗斯目前未批准任何转基因作物的商业化种植。日本只批准了转基因康乃馨的种植。在印度只有棉花是唯一进行商业化种植的转基因作物。（4）中国，2010年上海世博会期间严格检测食品中转基因成份、有毒有害物质、病原体，保证前来参会的各国人士的食品安全和生命健康。同时我国一些转基因育种专家却声称要在3至5年内将转基因主粮推上中国人的餐桌。五，转基因作物的推广严重威胁中国的粮食主权安全美国原国务卿基辛格曾经说过：“如果你控制了石油，你就控制了所有国家；如果你控制了粮食，你就控制了所有的人”。转基因粮食不仅是“生物安全”问题存疑，而且还存在巨大的“粮食安全”和“政权安全”隐患。传统农业可以从收成中留种，但转基因种子必须每年都购买新种子。垄断企业为了防止农民留种，发明了“自杀种子”， 这样跨国巨头便可以保证农民必须每年购买种子，以保证自己巨大的商业利益。将种地留种的权利拱手交给别人，尤其是把遏制中国作为主要战略的美国的公司，对中国的粮食主权是一个极大的威胁。转基因粮食的关键技术在美国人手里，这使中国的粮食安全存在巨大隐患！ 我国正在申请商业化种植及在研的8个转基因水稻品系中，没有一种拥有独立的自主知识产权，相反，孟山都在转基因粮食方面申请了533项专利技术，几乎覆盖了粮食生产一切环节，这意味着中国一旦在粮食上大面积推广转基因粮食后，每年要向美国公司支付昂贵的购买粮种费和交专利费。除专利外，孟山都还迫使农民必须使用转基因种子专用的除草剂、化肥，农民一旦使用了美国的转基因种子，就必须不断向孟山都等美国种子供应商购买新种子和化肥、农药，从而沦为美国种子公司的新农奴。中国如果大规模推广转基因粮食，我国很快将丧失粮食生产的主动权。这样跨国公司就会控制中国的粮食生产，国家的命脉受制于美国，国家的主权和安全性将无从谈起，粮食将变成美国控制中国的武器。一旦中美关系紧张，美国完全可以停止向中国提供转基因粮食技术和种子，13亿中国人将陷入饥饿和混乱中，“粮食安全”问题就会转变为“政权安危”，中国将会沦为受美国控制的殖民地。2009年中国大豆进口4255万吨，绝大部分是从美国进口的转基因大豆，然而中国只生产了 1450万吨的非转基因大豆。东北大豆种植和榨油产业受外国进口大豆的冲击几乎近于破产，跨国公司控制了我国大豆产业链，不仅危害中国人民的身体健康，还掠夺了大量中国人民的财富。六，转基因作物对生态环境的危害转基因作物的巨大危害还有就是对原始的野生农作物具有灭绝作用，我国一旦大规模推广转基因稻米的生产势必带来种子污染，当人们发现转基因稻米的缺陷，希望改用中国原有稻米种子的时候，原有种子已经由于基因漂移等污染而不复存在。转基因稻米产业化和商业化生产的不可逆性，是各国都不同意贸然在主粮上接纳转基因技术的主要原因，因为一旦踏上了此途，就是走上了不归路！此外，依赖上除草剂的转基因种子还会带来更恶劣的后果。阿根廷在播种转基因大豆后，只能用孟山都生产的除草剂，因为这种除草剂可以除掉全部杂草，只有孟山都的大豆种子对其有耐受性，除草剂通过机器喷洒，使得阿根廷的本国作物也会被当成杂草杀死，本土种子绝种、传统农区受到及其严重的影响。如果转基因粮食大量占领市场，中国原有的作物良种一旦消失，中华民族将面临着走投无路民族灭亡的灾难绝境。七，我国有哪些农作物是转基因？中国目前老百姓吃的大豆油绝大部分和大部分大豆制品都是转基因食品。这些大豆主要来自美国、以及种植美国转基因大豆的阿根廷和巴西。中国已经种植过转基因棉花、番茄、甜椒、木瓜等作物。大米：虽然农业部2009年才批准安全证书，并且还未批准其大规模商业种植。但是在2005年前后，已经有一些地区非法种植了转基因稻米，这些转基因大米被夹杂在普通大米中出售。2010年4月《中国新闻周刊》报道转基因水稻种子的销售渠道已经遍布湖北、江西、安徽、江苏、四川、湖南、河南、浙江等地。我国目前几乎涵盖所有食品的100多个转基因项目中到底有多少已经非法流入市场，人们根本无从知晓。根据此前转基因稻种、大米、玉米、蔬菜、瓜果等所有转基因种子、食品进入市场的过程都是偷偷摸摸的情况看，人民大众已经陷入了转基因食品的包围中，已经丧失了不吃转基因食品的选择权

(1) 尿液样品采集需要马上进行萃灭：快速使组织或细胞内的酶失活，防止代谢物的变化。液氮速冻是常用的萃灭方式。尿液采集后需立即放入-80℃或液氮保存。在NMR分析中，建议用0.2um滤膜过滤除菌。GC-MS分析中，由于尿素高温分解产生的氨气可能对检测其他物质造成干扰，因此分析前应加入尿素酶除去尿素。样本量要求200µL/例。LC-MS分析对样品则要求较少，仅需要弃去沉淀冻存即可。（2）血液样品：包括血浆和血清，血清中代谢物的含量略高于血浆，血清和血浆均可用于代谢组学研究，但是取样尽量一致，要么都用血清，要么都用血浆。血浆样品：应使用肝素钠抗凝管（EDTA等其余抗凝剂会对质谱信号有影响）采集全血，并尽快进行血浆分离：3000 rpm室温离心10 min，待血细胞完全沉降到管底后，取上层，0.2 mL/管分装至1.5 mL离心管中。-80°C冻存，干冰寄送。样本量要求100-200µL/例。血清样品：血液收集在离心管中37°C(或室温)静置30 min或1 h进行凝固分层；3000 rpm室温离心10 min，待血细胞完全沉降到管底后，取上清转至干净的离心管中； 再12000 rpm 4°C离心10 min，取上清分装到1.5 mL离心管中，每管0.2 mL，-80 °C冻存，干冰寄送。样本量要求100-200µL/例。现在市面上提供代谢组学的公司基本上都是基于LC-MS, GC-MS, NMR这三种技术展开。NMR技术的优点是样品可回收利用，但对复杂样品：例如血液样品的代谢组学分析，稍显力不从心，基于NMR的代谢组学数据库还没有大型的可参考标准物质谱图，这就使得解析谱图异常困难，遇到多物质的谱图重叠等问题很难解决。GC-MS由于需要样品衍生化，会有一部分物质丢失，并且由于精密度等原因，所测得的物质较少，并不能完整的反应该时刻的代谢轮廓特征。由于高分辨质谱的发展，配备有高分辨检测器的LC-MS例如LC-TOF-MS越来越成为了代谢组学样品分析的有利武器。并且随着MASSBANK, METLIN，HMDB等数据库的完善，使得LC-MS的数据的物质鉴定效率大大提升。不光如此，在样品的前处理中，使用LC-MS技术所需的处理步骤最为简单，可以很大程度上减少代谢物的流失。因此高分辨LC-MS技术已成为代谢组学中的主流手段被广泛使用。目前国内做代谢组学的单位有很多，价格不一。如果是华北地区，可以考虑百泰派克，这家公司的价格很合理技术也挺好。注意事项：建议尽量多的收集样本并分装冻存，100-200µL/管较为合适，且避免反复冻融。

生物标志物作为最直接快速有效的诊断手段，其筛选与获得可在疾病诊断、发展、治疗、以及疗效监测等多个方面发挥重要的作用。同时也是药物开发的重要靶标。近年来寻找和发现有价值的生物标志物已经成为目前研究的一个重要热点。目前已有多种技术平台被应用于生物标志物研究，如包括基因组学、蛋白质组学、肽组学、代谢组学等在内的组学平台，以及包括纳米技术、生物信息学、抗体芯片、高内涵筛选技术、无标记相互作用分析技术等多种前沿技术在内的手段与方法，都为快速获得及筛选生物标志物带来了极大的可能。医疗是医学的未来发展方向，精准医疗包括精准预防，诊断，治疗和预后四个层面。精准医疗发展关键在于biomarkers的发现与临床实践。biomarkers的发现途径与应用领域近年来被极大的拓展。首先biomarkers源方面，除经典的血液中蛋白质标志物外，越来越多从各种体液（如唾液，汗液，尿液等），人体微生物组，以及组织学，细胞学（如循环CTC）中拓展发现源；从生物标志物种类来看，包括细胞层面，蛋白层面，外泌体，表观遗传层面，以及DNA和RNA遗传层面；而技术平台也包括纳米技术，芯片，深度测序，以及高内涵筛选技术、无标记相互作用分析技术；而临床应用方面，不仅仅是诊断，还包括疾病预防，治疗与转归的分析，同时也广泛应用到各个科别。国际上将biomarkers发现与应用列入到较高的战略地位。美国国家癌症研究所（NCI）在2016年财政年度拨款550万美元资助建立多家实验室以便加快研究生物标志物和开发生物标志物测定方法用于检测乳腺癌、前列腺癌、肺癌、泌尿生殖器官癌以及发病率快速上升的癌症。生物标志物开发实验室（Biomarker Developmental Laboratories, BDLs）将成为NCI早期检测研究网络（Early Detection Research Network）的一部分。这是精准医学时代发展的新动向。

超高效液相色谱（UPLC）的应用 本文为药物分析网所有，转载请注明 超高效液相色谱是分离科学中的一个全新类别， UPLC借助于HPLC的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。 超高效液相色谱（UPLC）是一个新兴的领域，作为世界第一个商品化UPLC产品的Waters ACQUITY UPLCTM 超高效液相色谱系统也是刚刚出现，因此目前已发表的文献资料还很缺乏。与传统的HPLC相比，UPLC的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍。因此其在蛋白质、多肽、代谢组学分析及其它一些生化领域里将会得到广泛应用。另外，在天然产物的分析方面，使用UPLC与质谱检测器连接，会对天然产物分析，特别是中药研究领域的发展是一个极大的促进。 在提到“蛋白组学”或“代谢组学”时，与没有“组”的差别从分析的角度说就是样品量极大，需要在短时间分析成千上万的样品。UPLC不损失分离度的高速度优点在这里就能充分体现。多数生化样品及天然产物都十分复杂，图1是多肽指纹图的HPLC与UPLC两个色谱图（紫外检测）比较。在同样条件下，UPLC能分离的色谱峰比HPLC多出一倍还多。图2是代谢产物分析的色谱图。在同样条件下，UPLC的分辨率能够认出更多的色谱峰（质谱检测器- LCT）。